成釉细胞瘤端粒长度与和htert表达相关性的研究

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1、·中文论著摘要·成釉细胞瘤端粒长度及与hTERT表达相关性的研究目的端粒由DNA重复序列和特定的端粒结合蛋白相结合而形成的核染色质组成，防止染色体融合，重组及降解，维持其完整性和稳定性。端粒的短缩及端粒的失能会导致染色体末端发生融合及重组，增加基因的不稳定，从而引发肿瘤的形成。端粒酶是一种细胞核糖核蛋白逆转录酶，能延长端粒长度，维持端粒的稳定和染色体的完整。端粒酶激活是细胞永生化和恶变的重要一环，近乎90％的肿瘤中都有端粒酶的激活。本研究采用荧光原位杂交技术对成釉细胞瘤进行端粒长度的检测，并探讨其与hTERT及成

2、釉细胞瘤生物学行为的关系。材料与方法1、研究对象荧光原位杂交所用标本取自中国医科大学附属口腔医院及第一医院病理科2001．2007年存档蜡块，共收集成釉细胞瘤89例(原发5l例，复发33例及恶变5例)，正常口腔粘膜(牙龈、颊)10例，口腔鳞癌12例。2、实验方法荧光原位杂交：石蜡切片经常规脱蜡、水化，抗原修复，蛋白酶K消化后乙醇脱水，滴加杂交液，盖玻片覆盖，90℃共变性，室温避光杂交，DAPI复染细胞核后甘油封片。hTERT免疫组化：石蜡切片经脱腊、水化，过氧化氢封闭后抗原修复，马血清封闭后，一抗过夜，二抗lh，

3、三抗SP．APlh，NBT．BCIP显色，甲基绿复染。ki67免疫组化：石蜡切片经脱蜡水化，抗原修复。一抗鼠抗人ki67核抗原单克隆抗体及LSAB'rM+／HRP试剂盒购自Dako公司，DAB显色。3、结果判定荧光原位杂交结果判定：FISH切片的数字图像由设于荧光显微(Olympus，CX61，日本)上的数码相机拍摄，用MoticImagesAdvanced3．2图像分析软件包对图像的荧光端粒信号光密度值进行定量。在每例切片中随机选取若干细胞，计算每个细胞的端粒荧光信号光密度值与其DAPI荧光信号的比值，然后计算

4、这些细胞的比值的平均值作为本例的端粒长度值。hTERT免疫组化结果判定：在高倍镜下(X200)X观察每张切片，>30％的肿瘤细胞着色定为阳性，依据染色强度分为弱阳性(+)，中度阳性(++)，强阳性(卅)。ki67免疫组化结果判定：以明确的细胞核棕色或深褐色着色者为阳性染色。每例样本计数1000个细胞，高倍镜下(X200)计数阳性细胞核，ki67阳性染色指数LI记为阳性染色细胞／细胞总数×100。4、统计学分析采用SPSSll．0统计软件包进行r检验，方差分析及Pearson相关分析，检验水准a=0．05，p

5、05为有统计学意义。结果1、成釉细胞瘤端粒长度的检测荧光原位杂交分析结果表明，89例成釉细胞瘤上皮细胞端粒平均长度为O．1260，12例口腔鳞癌上皮细胞端粒平均长度为0．0487，10例正常口腔粘膜上皮细胞的端粒平均长度为0．2105，组间比较有统计学差异(仁＆965，P=O．000)。2、成釉细胞瘤中hTEI盯的表达89例成釉细胞瘤中64例hTERT均为阳性，表达率为71．9％，阳性表达以中度为主，主要位于外周柱状细胞或立方状细胞中，且在胞核及胞浆呈弥散分布。与成釉细胞瘤相比，10例口腔正常粘膜中除2例hTER

6、T呈中度表达外，其余8例均为阴性，12例口腔鳞癌hTERT表达均为阳性，三组hTERT阳性率及表达强度具显著统计学差异∞=154．459，P=O．000；)(2=111．486，P=O．000)。按生物学行为分组，随成釉细胞瘤的复发与恶变hTERT阳性率增高，64．7％(33／51)的原发组hTERT为阳性，78．8％(26／33)的复发组hTERT为阳性，100％(5／5)的恶变2组hTERT为阳性，且这一差异具有统计学意义(r---32．517，P=O．000)，三组hTERT表达强度之间亦具显著差异(r=5

7、5．202，P=O．000)。3、成釉细胞瘤端粒长度与hTERT表达之间的相关性按hTERT的表达强度对将成釉细胞瘤分为三组，hTERT(．)组端粒平均长度为0．097，hTERT(+)组端粒平均长度为0．136，hTERT(H)组端粒平均长度为0．140，随着hTERT表达的增强，端粒长度有增长的趋势，但这一差异无统计学意义(F=J．984，P=O．144)。4、成釉细胞瘤中ki67的表达及与端粒长度和hTERT表达的相关性ki67阳性染色的部位为细胞核，呈深棕色或深褐色，阳性染色细胞以肿瘤上皮细胞为主，星网状

8、细胞阳性染色相对较少，间质细胞偶有阳性表达。不同组织学类型成釉细胞瘤中ki67表达无差异(弘n762，P=0．520)。ki67的表达与端粒长度呈现负相关的趋势(，．=一0．151，P=0．23I)。伴随成釉细胞瘤的复发与恶变，ki67的表达增强(F=4．344，P=O．017)，且与hTERT的表达趋势一致，相关分析表明ki67与hTERT间存在相关(r=0．282，P