庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制研究

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1、福建医科大学硕士学位论文庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制研究姓名：顾晰申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：张榕;林昶20090301庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制研究中文摘要【目的】探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiralganglioncell，SGc)的损伤机制。【方法】取出生后2～6天昆明种乳小鼠耳蜗，利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出SGC，并进行体外培养。将培养4天的SGC用4％多聚甲醛室温固定30min，以小鼠源神经纤维细丝蛋白(Neurofilam

2、ent一68／200Kda，NF—L+H)单克隆抗体作为一抗，按照SP法对所培养细胞进行免疫细胞化学染色，对SGC作出鉴定。将培养第4天的细胞分为4组：空白对照组及3种浓度的庆大霉素干预组(庆大霉素终浓度分别为50mg／L、lOOmg／L、150mg／L)，作用48h后对各组细胞进行透射电镜观察以及凋亡效应蛋I刍Caspase一3免疫细胞化学染色，染色结果用图像分析系统及SPSS统计学软件进行定量分析。【结果】SGC原代培养获得成功，一般有相对生长的两个突起，为典型的双极神经元，经NF-L+H抗体免疫细

3、胞化学染色，其胞质及突起均呈阳性反应，染成棕黄色。在透射电镜下观察SGC超微结构，3种浓度的庆大霉素组SGC与空白对照组相比，均出现明显的形态学改变，以细胞核和线粒体为著，这种改变与凋亡相关。庆大霉素组SGC出现明显的凋亡效应蛋白Caspase-3阳性反应，与空白对照组相比，有显著性差异，且随着庆大霉素浓度的增高，Caspase-3阳性反应程度也升高。【结论】庆大霉素对小鼠耳蜗SGC有直接毒性作用，可导致SGC凋亡，线粒体损伤在这一过程中可能具有重要意义。Caspase-3的激活参与了庆大霉素致SGC凋

4、亡过程。【关键词】庆大霉素类螺旋神经节细胞，培养的显微镜检查，电子，透射细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶33Studyoftheinjurymechanismofculturedspiralaanalioncellsfromousecochleinducedganglioncells[rommonsecoCllleainduce1bygentamicin·■-Abstract[Objective]Toexploretheinjurymechanisminspiralganglioncells(S6C)of

5、postnatalmousecochlearinvitrocausedbygentamicin．[Methods】SGCswereisolatedbyusingacombinatorialapproachofenzymaticdigestionandmechanicalseparationfromP2～6Kunmingmousecochlear．After4days，culturedSGCswerefixedby4％paraformaldehydeinroomtemperatureandthenimmu

6、nocytochemicalidentificationwasperformedbymethodsofS-Pandthemonoclonalantibodyofmouseneurofilamentprotein(Neurofilament一68／200Kda，NF—L+H)．SGCsofthe4thdayinvitrowererandomlydividedintoblankcontrolgroupandthreeGentamicinexperimentalgroups(theconcentrations

7、ofgentamicininthemediumwere50mg／L，lOOmg／L，150mg／L)，andculturedfor48h．CollectSGCsfromdifferentgroupsrespectivelyandobservethecellsofeachgroupwithtransmissionelectronmicroscopy．TheexpressionofapoptoticexecutiveproteinCaspase。。3ineachgroupwastestedbyimmunoc

8、ytochemicalmethodandthestainingresultwasanalyzedquantitativlybyimageanalysissystemandSPSSstatisticalsoftware．【Results]TheprimarycultureofS6Cswassuccessful．SGCsusuallyhavetwoneuritesgrowingrelativelytoeachotherandareclassic