宏基因组学和道地药材的研究

《宏基因组学和道地药材的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、“”潞蒜茹黑嚣；：蒜簇麓麓；茹。。t姓∞12$H月々tcsNR±目■10目$自＆*#自％女《{}*H￡■^■宏基因及宏基因组学1宏基固组(学)概念(略)2窟基因组技术宏基因组技术流程如下：⋯一t”／＼／＼、，11“。川。看●i’1d⋯t-1⋯⋯-⋯旨三●■thtn一⋯№∞■u⋯三■图l宏基因n技术流程l21环境样品DNA的提取环境中总DNA的提取是整个宏基因组研宄的第一步，所得到DNA的质量直接影响序列拼接以及构建文库的质量。群体总DNA在不同环境需要不同的提取方法，根据本文研究内容，现主要针对土壤环境中总DNA提取方法进行概述。土壤总DN

2、A的提取丰要分为两大娄：直接提取法和问接提取法”o。二者主要区别在于是否先分离土壤中的微生物。直接提取法在所采集的环境样品中加入适当的裂解液让细胞充分裂解，使D14A游离出来，再进一步分离纯化，从而得到符合实验要求的DNA样本。而间接提取法则是先将土壤中的微生物用适当的方法分离出来，在个相对纯净的环境中裂解细胞，释放DNA。一者比较见衰l。表1两种提取土壤总DNA方法比较口接ⅨR注间接提取法步gI细胞裂解：物Ⅱ洁、化学注和酶样珐l微生物的分离2核酸分离与纯化2细胞裂解3核酸分离与纯化特点：菡蕊嚣?i器甏ii呈勰冀菪器鬣妻‰嚣ii；；；赫8二

3、者各自有自身优缺点，研究人员应在实际操作中根据实验的要求和目的选择台适的方法。122宏基固组t库的构建宏基因组文库的构建需要选择合适的载体和宿主。载体选择主要依从有利于目的基凶扩增和表达的原则。目前构建老基因组文库所用的载体主要包括质粒载体如l*mm)、粘粒载体(cos唧由和细菌人工染色体帕acknalanmcIalchromosome，BAD。质粒载体一般用于克隆7一10kb的片段，粘粒载体用于克隆40kb左右的片段，而用细菌人工染色体的克隆片段可达350kb。前者用于单基因片段的克隆与表达．后两者用于太片段插入文库的构建【lq。同时也有

4、采用Fosm-d作为载体构建稻田土壤、海绵等宏基因组的文献报道I””]。宿主的选择要考虑转化效率，重组载体在宿主细胞中的稳定性．宏基因的表达等因素。构建宏基困组文库最常用的宿主是大肠杆菌”“，其次变铅青链霉苗、恶臭假单胞杆苗也可咀作为宿主”+”J。专科-熙麓器翥燃盏㈣淼未簇釜慧讨厶满藤2012海陕两岸蕾CSNR全国第’O居中药及天然药物资潦拳术研讨会灞隧固《霸甓1．2．3宏基因组文库的筛选宏基因组文库的筛选分为功能驱动筛选(nmction一“venscreening)和序列驱动筛选(sequence．drivenscreening)[16】

5、。功能驱动筛选基于重组基因克隆产生新活性来筛选，该法需要目的基因在宿主细胞中有很好的表达。功能驱动筛选可以迅速的找到酶和抗生素等天然产物，但筛选工作量大，效率较低。序列驱动筛选是根据己知基因序列来设计探针或者PCR引物来筛选宏基因组文库，从而得到目的序列。通过这种方法在克隆出的一些随机序列中往往会有重要发现。但是采用序列驱动筛选的方法需要对目的基因序列有一定掌握，因此对于那些完全未知的基因是无法通过这种手段获取的。1．3宏基因组在生物领域的应用随着分子生物学技术的发展，宏基因组学已广泛应用到医药、生态、农业等研究领域。马世宏等人利用宏基因组

6、学技术研究转基因植物土壤环境微生物多态性，从而确保大面积种植转基因作物对生态环境的安全性[1丌。路杨通过构建氯酚污染土壤微生物宏基因组文库首次获得除草剂2，4．D(2，4．二氯苯氧乙酸)降解相关基因，为除草剂抗性机理的研究提供理论基础[18

7、。赵静等人【l引构建了南极土壤微生物宏基因组文库，运用差异性DNA修复试验(DDRT)筛选文库，采用MTT法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定，找到了对卵巢癌细胞生长具有抑制作用的克隆子AE一3。GillesDie等人【20】从土壤宏基因组文库中筛选并命名了具有广谱抗菌活性的抗生素turboⅡ1y

8、cinA和turbomycinB。2．宏基因组学在道地药材研究中的应用道地药材通常指来自特定产区、生产历史悠久、栽培加工技术精细、质量优良、疗效显著的药材，是某些调节植物代谢产物合成的关键酶基因的表达的时空差异121。22J。根际微生物对药用植物次生代谢合成起关键作用。生态型(eco咖e)是指一个种对某一特定生境发生基因型反应的产物。中草药品质优劣和疗效差异在于其所含化学成分的不同，而实质上这种差异是由于生态型不同，植物个体在形态、生理、生化上的变化所导致。影响道地药材生长的环境因素很多，其中根际微环境在药用植物次生代谢产物形成中起着重要作

9、用【2j。2．1环境微生物对道地药材形成的影响根际微生态系统由植物、土壤与微生物三者相互作用形成，其中根际微生物细菌数量可达到109cm～，影响着土壤的物质转化和能量传递，调节根