血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9对恶性胸腔积液的诊断价值

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1、遵义医学院2005屙硕I：研究生毕业论文一．材料(一)主要仪器1．水平式离心机2．超低温冰箱3．酶联免疫检测仪4．自动放免仪(二)主要试剂1．PC【IIRIA试剂盒2．1V型胶原RIA试剂盒3．层粘蛋白Ilia试剂盒4．VEOFELISA试剂盒5．哪P一9ELISA试剂盒材料与方法北京医用设备厂f=}本Sanyo电器有限公司B10--TEKInstrumentsInc中国科大中佳公司上海海军医学研究所深圳晶荑生物工程有限公司北京中山生物有限公司二．研究对象以2004年4爿～2005年3月期间在遵义医学院附

2、院未经治疗的66例胸腔积液患者为研究对象。恶性胸腔积液20例，其中男13例，女7例。年龄38～71岁，平均57岁。原发病包括肺癌17例，乳腺癌2例．肝癌l例。所有病例均有组织学证据。其中根掘胸水中找到癌细胞确诊10例．根据纤支镜活检或手术后病理检查确诊肺癌、乳腺癌或脬癌10例。结核性胸腔积液46例，其中男35例，女lI例。年龄16～92岁。平均40岁。根据痰结核菌和胸水找到结核杆菌确诊5例，其他均经典型临床表现、胸腔积液分析，胸片及cT表8遵义茨学院2005届{孽l：卜研究生毕业论文现、PPD皮试、血清抗

3、结核抗体检测或诊断性治疗有效而确诊。三．实验方法1．标本采集所有病例均在无菌操作下行脚穿，采样前均未行化疗和局部胸腔注射。取胸水适量立即4"C3000rm／min离心20分钟，取上清液分装，霹一70℃冰箱保存待测．2．VEGF的检测提前20分钟从冰箱中取出试荆盒，平衡至室温，将浓缩洗涤液用双蒸水稀释，加入标准品和样本稀释液lml至标准品中，待彻底溶解后，静簧15分钟混匀(浓度为20ng／m])，然后根据2000、1000、500、250、125、62．5、31．25、Opg／mL进行稀释，以生物素化抗体稀

4、释液稀释生物素化抗体(1：200)，提前15分钟配制，以酶结合物工作液稀释浓缩酶结会物(1：200)，提前15分钟配制并避光。从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，除空白孔夕}，分别将2倍稀释标本和不同浓度标准品(100ul／孑L)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37"C孵箱孵育90分钟，沈板4次，除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100ul／孔)，片j封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟，洗扳4次，除空白孔外，加入酶结合物工作液(100ul／孑L)。封住板孔．37"C孵箱孵育30分钟，洗板4

5、次，加入底物显色剂lOOulliL，37。C避光孵育15分钟，加入终止液lOOul／iL，混匀后立即测量oD。。值，每个标准品和标本的oD值减去零孔的0D值。以标准品浓度作横坐标，oD值为纵坐标，使用酶联免疫检测仪厂家配备的KCjuniOF软件分析计算浓度。3．raP-9的检测设标准曲线8孔，每孔巾各hnx．样品稀释液lOOul，第--；／LDii标准品lOOul，混匀后用加样器吸出lOOul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出IOOul弃去，使之体积均为lOOul。第八孔为空白

6、对照．待测品孔每孔中加入胸水标本lOOul，将反应板充分混匀后置37℃温箱120分钊·，倾去液9遵义医学院2005届硕J：研究生毕业论文体．用洗涤液洗4次，拍干，每孔中加入第一抗体工作液50ul，将反应板充分混匀后置于37"C温箱60分钟，倾去液体，用洗涤液洗4次，拍干，每孔加酶标抗体工作液lOOul，簧于37"C温箱60分钟，倾去液体，用洗涤液洗4次，拍干，每孔中加入底物工作液lOOul，置于37"C暗处10分钟，每孑L加终止液一滴。立即在酶标仪波长492nm处测∞值，各测定孔OD值减空白对照孔(Ong

7、／m1)OD值，为测试实际oD值，以标准品1000、500、250、125、62．5、31．25、15．625、Ong／ml之oD值作纵坐标，以标准品浓度为横坐标，使用酶联免疫检测仪厂家配备的KCjunior软件分析计算浓度。4．POIlI的测定将5ml离心管分别作好NSB管、标准管、质控管和样品管标记，在NSB管中顺次加入lOOul零标准液和200ulPBS：在标准管、质控管、样品管中各加入lOOul标准品；质控血清lOOul：样品lOOul，除NSB管外其他管加入200ulPCIII抗体：所有管中加入

8、“I—PcIIIlOOul，4℃放置d小时：加入分离剂500ui。室温放置20分钟，3000rpm离心20分钟，用抽吸法吸弃上清液，测沉淀放射性计数后结果按BIBO=((B—NSB)／(B0一NSB))*100％计算各标准点结合率，以结合率为Y轴(Y=In(BIBO)／(卜BIBO))，标准品浓度为x轴(x=In(c．PCIII))，使用自动放免仪分析计算浓度。5．Ⅳ型胶原的检测将5ml离心管分别作好NSB管、标准管、质控管和