干细胞移植对糖尿病后肢缺血大鼠骨骼肌中生长因子表达影响初步的研究

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1、中文摘要干细胞移植对糖尿病后肢缺血大鼠骨骼肌中生长因子表达影响的初步研究摘要目的：随着社会的发展和进步，人们生活水平的不断提高和生活方式的改变，糖尿病患病率在我国乃至全世界范围内呈逐渐上升趋势。糖尿病久病可引起眼、肾脏、神经、血管等并发症，截至目前为止，关于糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病的研究，国内外报道的很多，但关于糖尿病的骨骼肌病变，国内外研究的较少。骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的组织之一，也是高血糖损害的主要靶位，高血糖和下肢缺血两个因素共同引起糖尿病下肢骨骼肌病变。近年来，生长因子在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复中的作用受到

2、了越来越广泛的重视。随着干细胞研究的进展以及分离、纯化干细胞方法的不断改进，使采用干细胞治疗等治疗性血管生成方法在缺血部位重建有效的侧支循环成为可能，目前临床上证实自体外周血干细胞移植术是一种较好的治疗糖尿病下肢骨骼肌病变的方法。本研究通过给雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)复制l型糖尿病大鼠模型，后结扎股动脉并离断制造糖尿病后肢缺血模型来复制糖尿病大鼠后肢骨骼肌病变模型，通过对部分大鼠实施自体外周血干细胞移植术，观察自体外周血干细胞移植术对后肢腓肠肌中血管内皮生长因子(vascularendothelialg

3、rowthfactor,VEGF)及中文摘要碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)表达的影响，探讨自体外周血干细胞移植术对糖尿病大鼠骨骼肌病变改善的情况，从而为临床上实施干细胞移植治疗糖尿病骨骼肌病变提供理论依据。方法：1糖尿病大鼠模型的制备健康Sprague．Dawlay(SD)雄性大鼠45只，适应性喂养1周后随机分为3组：正常对照组(A组)15只、糖尿病后肢缺血组(B组)15只、糖尿病后肢缺血后干细胞移植组(C组)15只。对B、C两组大鼠，空腹12d'时后给予腹腔注射STZ65mg／kg复制

4、1型糖尿病模型，注射STZ72d"时后测血糖，以血糖大于16．65mmol／L定为造模成功。2糖尿病大鼠后肢缺血模型的制备糖尿病造模成功后7天对糖尿病大鼠实施双后肢股动脉结扎并离断造成糖尿病大鼠后肢缺血模型，后为预防伤口感染，每天给予肌肉注射青霉素4万单位／只，共3天。在实验过程中，B组大鼠死亡2只，C组大鼠死亡1只。3干细胞动员在糖尿病后肢缺血造模成功后第7天，C组大鼠开始每天给予皮下注射粒细胞集落刺激因子0．CSF15pg／kg，连用3天，给药后第3天采集各组大鼠内眦静脉血进行白细胞数值监测。4实施自体外周血干细胞移植术C组大鼠每只心脏采血5

5、ml，加入抗凝管中，与Hank’S液1：1混匀后，小心加于10ml的细胞分离液之液面上，以2000转／分离心15分钟，收集界面上的细胞，放入含Hank’S中文摘要液20．25ml的试管中，充分混匀后，以1500—2000转／分离心10分钟，吸去上清液，沉淀经反复洗2次即得所需细胞。用lml无菌注射器抽取细胞，制成5x108／ml的细胞悬液，分别在C组每只大鼠左下肢腓肠肌处多点肌肉注射。5标本收集干细胞移植后4周心脏采血，后处死大鼠，并留取每只SD大鼠后肢腓肠肌中段肌肉各0．5cmX0．5cmX0．3cm，分别置于10％的福尔马林中保存，待行HE染

6、色观察三组病理结果，行免疫组织化学染色测定后肢腓肠肌中VEGF及bFGF的表达情况。6观察指标6．1血糖的测定血糖用葡萄糖氧化酶法测定。测定步骤：准备3只试管：空白管、标准管、测定管，均加入酶、酚试剂各1．5ml，标准管加入标准液0．02ml，待测管加入待测样本0．02ml，混匀后于37。C保温15分钟，以空白管调零，测定各管吸光度值。测定参数：波长505nm，温度37℃。6．2外周血白细胞的测定取大鼠内眦静脉血lml，利用流式细胞检测仪进行白细胞计数。6．3腓肠肌组织形态学检查常规方法制备大鼠腓肠肌光镜切片，行HE染色，镜检。6．4腓肠肌中VE

7、GF和bFGF蛋白表达常规方法行大鼠腓肠肌免疫组织化学染色测定下肢腓肠肌中VEGF和bFGF的表达情况。6．5镜检：中文摘要在光镜下观察各组骨骼肌形态学，每组选择50张切片在高倍镜下观察VEGF和bFGF蛋白的表达，VEGF和bFGF为胞浆着色，阳性细胞染成棕黄色，以不表达定为(．)，低度表达定为(+)，中度表达定为(++)，强表达定为(+++)。7统计学处理所有数据用SPSSl3．0软件处理，计量资料以均数土标准差表示，组间差异用两样本均数的t检验进行比较，两组以上比较采用单因素方差分析作统计学处理。各组间VEGF和bFGF表达的比较用非参数检

8、验，检验的显著性用尸值表示。P<0．05为差异有显著性，P<0．01为差异有极显著性。结果：1糖尿病造模后3日后大鼠出现明显的多饮、多食