利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究

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1、江南大学博士学位论文利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究姓名：傅瑞燕申请学位级别：博士专业：发酵工程指导教师：陈坚20060301摘要乳酸乳球菌是乳制品发酵工业中重要的发酵剂，也是最为常用的诱导表达型宿主菌，具有重要的经济价值，是颇受关注的一种乳酸菌。然而，由酸胁迫导致的较低生物量和由氧胁迫导致的对生产条件的较高要求，是乳酸乳球菌在食品工业和代谢工程应用中主要的不利因素。如果能在深入理解胁迫抵抗机制的基础上，找到提高乳酸乳球菌胁迫抗性的途径，实现粗放生产条件下浓缩型发酵剂的生产和“细胞加工厂”的高密度培养，将会极大地推动乳酸

2、乳球菌在工业生产中的应用。但是，迄今为止，国外有关提高乳酸乳球菌酸胁迫和氧胁迫抗性的报道寥寥无几，而在国内与乳酸乳球菌胁迫相关的研究仍属于空白。本论文以不能生物合成谷胱甘肽(GsH)也不能从外源吸收GsH的乳酸乳球菌乳脂亚种NZ9000和不能生物合成GSH但能够从外源吸收GSH的乳酸乳球菌乳脂亚种SKll为实验菌株，以提高乳酸乳球菌好氧生长性能为目标，利用代谢工程手段在乳酸乳球菌Nz9000中生产来源于茂原链轮丝菌的谷氨酰胺转胺酶(MTG)；在乳酸乳球菌sKll中生产GsH来改善乳酸乳球菌菌株对酸胁迫和氧胁迫的抗性，并对其机理进行深

3、入探讨。主要研究结果如下：1．通过构建能够在胞内活性表达MTG编码基因所辔的乳酸乳球菌Nz9000(pFL01o)，发现在乳酸乳球菌Nz9000中生产MTG可以显著改善宿主菌的好氧生长性能。在控制pH为6．5±0．1的条件下，乳酸乳球菌NZ9000(pFL010)在CM培养基(不含pH缓冲剂)中好氧生长的最高生物量为4．73g·L一，是对照菌乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的1．8倍；并且，乳酸乳球菌Nz9000(pFL叭O)的细胞对葡萄糖平均得率(YX／s)最高为711g．mol～，是乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148

4、)的2．6倍。在不控制pH的条件下，乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)在CM培养基中好氧生长的最高生物量为4．13g·L_l，是乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的12．1倍：并且，乳酸乳球菌Nz9000(pFL叭0)的最高Y)(，s为72．9g．mol一，是乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的5．4倍。2．分析了Ⅲ坦基因的本底表达对乳酸乳球菌NZ9000生理产生的影响。首先，乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)细胞壁明显增厚，阻碍了基因表达诱导物乳酸链球菌素(nisin)诱导信号的传递，因而nisin对乳酸乳球菌

5、NZ9000(pFL010)中m嵋基因无诱导表达作用，并且乳酸乳球菌Nz9000(pFLOlO)具有了对高浓度Ilisin(500嵋·mL_1)的抗性。其次，乳酸乳球菌Nz9000(pFL叭o)的胞内pHOH。)升高，使其胞内乳酸脱氢酶(LDH)活性降低，NADH氧化酶活性升高。由于NADH的高效氧化致使LDH途径丧失，造成乳酸乳球菌Nz9000(pFL叭O)发酵液中乳酸含量低于检测限。并且，代谢产物的分析表明MTG的活性导致丙酮酸节点的代谢流向发生了显著的改变。在乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)发酵液中，源自丙酮酸的主要代谢

6、产物(乳酸，乙酸，乙醇，3一羟基一2一丁酮，双乙酰和2，3一丁二醇)的浓度均有不同程度江南大学博士学位论文利用代谢工程手段改善乳酸乳球菌胁迫抗性的研究的降低。然而，源自丙酮酸的次要代谢产物，如异戊醇、苯乙醇和苯乙胺的产量至少比乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)高10倍。3．Ⅲ辔基因的本底表达可以显著增加乳酸乳球菌NZ9000对氧胁迫的抗性。处于对数中期的乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)经H202胁迫(50mm01·L-f，80min)和甲萘醌(20H1H10l·L‘f，80m曲)胁迫后的存活率分别是乳酸乳球菌Nz9000

7、(pNz8148)的83．7倍和178'^倍。并进一步发现MTG具有在体外直接清除H202和02一的微弱的抗氧化活性。同时，MTG的交联反应产物没有清除H202的作用。4．m辔基因的本底表达能够增强乳酸乳球菌Nz9000对酸胁迫的抗性。在pH2．5的条件下胁迫15mill、30miIl和45miIl后，处于对数前期的乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)的存活率分别是乳酸乳球菌Nz9000(pNZ8148)的1．6倍、2_2倍和3．9倍。但是，处于稳定期的乳酸乳球菌Nz9000(pFLOlO)对酸胁迫的抗性反而比乳酸乳球菌Nz900

8、0(pNz8148)弱。可能的原因是较高的pH。。会抑制乳酸乳球菌Nz9000自身酸胁迫诱导型的抗酸胁迫机制的活性。5．在高致死率的胁迫条件下，GSH可以增强乳酸乳球菌Nz9000对H202和甲萘醌所引发氧胁迫的抗性。经50mmoI·