SNT2428-2010-犬瘟热诊断方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４２８—２０１０犬瘟热诊断方法犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犮犪狀犻狀犲犱犻狊狋犲犿狆犲狉２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４２８—２０１０前言本标准的附录Ｃ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张子群、谢晓峰、岳志芹、何浩、徐义刚、李维刚、由轩、

2、金宁。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４２８—２０１０犬瘟热诊断方法１范围本标准规定了犬瘟热（ＣａｎｉｎｅＤｉｓｔｅｍｐｅｒ，ＣＤ）的检疫技术规范，包括犬瘟热病毒（ＣＤＶ）的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验。本标准适用于犬瘟热的检疫。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些

3、文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３概述犬瘟热（ＣＤ）相关资料参见附录Ａ。ＣＤ的诊断可以通过流行病学、临床症状、病理剖检变化对犬瘟热作出初步诊断，对ＣＤ作出确诊可进行病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验等实验室诊断。４临床诊断根据临床症状和病理学检查，参见附录Ｂ，可做初步诊断依据。５实验室诊断技术５．１病毒分离与鉴定５．１．１材料准备５．１．１．１实验材料和试剂５．１．１．１．１Ｖｅｒｏ细胞（非洲绿猴肾细胞）、ＭＤＣＫ细胞（犬肾传

4、代细胞）。５．１．１．１．２溶液配制：包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、ＰＢＳ等。配方及配置方法见附录Ｃ。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．１．１．２设备和器材５．１．１．２．１细胞培养瓶、细胞培养板。５．１．１．２．２吸管。５．１．１．２．３二氧化碳培养箱。５．１．１．２．４３７℃恒温水浴箱。５．１．１．２．５普通冰箱和低温冰箱。５．１．１．２．６离心机及离心管。５．１．１．２．７研磨器械。５．１．１．２．８普通光学显微镜和倒置显微镜。５．１．１．２．９微量加样器，容量５μＬ～５０μＬ，５０μＬ～２００μＬ。１犛犖

5、／犜２４２８—２０１０５．１．１．２．１００．４５μｍ微孔滤器。５．１．１．３组织悬液的制备ＣＤＶ存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用加双抗（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ）的细胞维持液，制成２０％组织悬液，４℃浸泡４ｈ，然后反复冻融３次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清液，－２０℃冷冻保存，备用。试验前，１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液，用于ＣＤＶ分离。５．１．２操作方法５．１．２．１细胞分离法用常规方法培养细胞单层，待长至８０％左右时，用于ＣＤＶ分

6、离。吸去培养液，用无血清培养液洗涤１次。如用细胞培养瓶，按１ｍＬ／２５ｃｍ２接种处理好的组织上清液，每样接种两瓶；如用细胞培养板，则按每孔０．１ｍＬ接种处理好的组织上清液，每样接种２孔。３３℃吸附１ｈ，弃去上清液，加入细胞维持液，置３７℃５％二氧化碳培养箱内培养，２４ｈ后逐日观察细胞病变，连续观察５ｄ～７ｄ。５．１．２．２结果观察ＣＤＶ感染Ｖｅｒｏ细胞３ｄ～４ｄ后、ＭＤＣＫ细胞２ｄ后，出现ＣＰＥ变化，细胞变圆，胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆内出现包涵体。若第一次接种后未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融

7、后盲传三代，进行观察。如仍无细胞病变，则判为ＣＤＶ检测阴性。５．１．２．３犆犇犞的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按５．２进行鉴定；或按５．３的方法制备细胞涂片，用ＣＤＶ单克隆抗体进行鉴定。５．２间接免疫荧光技术５．２．１材料准备５．２．１．１试剂５．２．１．１．１磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：配制见附录Ｃ。５．２．１．１．２ＣＤＶ单克隆抗体：使用前稀释成适当的工作浓度。５．２．１．１．３ＦＩＴＣ荧光素标记羊抗鼠ＩｇＧ抗体：使用前用０．０２％伊文斯蓝稀释至工作浓度。５．２．１．１．４碳酸盐缓冲甘油：配制见附录Ｃ。５．２．１．２器材５．

8、２．１．２．１荧光显微镜。５．２．１．２．２可调微量加样器（５μＬ～５０μＬ，５０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。５．２．１．２．３３７℃恒温水浴箱。５．２．１．２．４载玻片和盖玻片。５．２．１．３样品５．２．１．３．１细胞培养物：按５．１用２４孔