SNT1376.1-2004-牛传染性胸膜肺炎病原分离鉴定.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNIT1376.1-2004牛传染性胸膜肺炎病原分离鉴定Isolationandidentificationofcontagiousbovinepleuropneumonia2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总IKSN/T1376.1-2004前言本标准的附录A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国四川出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李玉冰、严玉宝、曹同雪、曹宗君、胡娟、马勇。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN

2、/T1376.1-2004牛传染性胸膜肺炎病原分离鉴定范围本标准规定了牛传染性胸膜肺炎病原的分离与鉴定方法。本标准适用于牛传染性胸膜肺炎病原的分离与鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准中引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法3设备主...灭菌拭子。段内乙恒温培养箱。段q︺普通显微镜。3.穿刺针及注射器。3.5净化工作台

3、。4培养基4.1试验用培养基包括运输培养基、10%马血清肉汤培养基、10%马血清肉汤琼脂培养基、普通10%马血清肉汤琼脂培养基、葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基和四氮哇盐生化培养基。4.2培养基配制方法见附录Aa4.3宝睑用A(,!r符合GB/T6682-1992中的二级水标准5样品的采集、运输和保存5.1活牛的样品采集用灭菌拭子采集鼻分泌或用注射器无菌穿刺采取胸腔液。5.2死牛的样品采集无菌采取肺部病变组织、肺部淋巴结、胸腔液、有关节炎的采取关节滑液。5.3样品的运输样品需长途运递的应将其置于运输培养基内，于4℃条件下48h内送达实验室。5.4样品的保存采集的样

4、品无法立即送实验室的或者实验室不能立即检验的，应将样品置一20℃保存。6病原分离培养6.1样品的处理6.1.1污染样品:将病料置于含500IU/mL青霉素及1，7000乙酸铭的肉汤中磨碎，10倍稀释后40C过夜，供接种用。SN/T1376.1-20046.1.2无污染样品:无菌抽取的胸腔液、关节滑液可直接接种。6.2样品的接种6.2.1取。.1mL-0.3mL样品无菌接种于5管10%马血清肉汤培养基中，置37℃培养直至第10de6.2.2用无菌接种环钩取样品划线接种于10%马血清肉汤琼脂培养基上，每个样品共接种5个培养皿。每个培养皿用胶布或者蜡封口，置37℃培养直至

5、第10do6.3生长观察6.3.1接种后第3d开始每天观察接种管及培养皿细菌生长情况直至第10d.6.3.2在10%马血清肉汤试管中，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为:初期呈轻微混浊或白色点状或丝状，后逐渐均匀混浊，呈半透明稍带乳光，无菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。6.3.3在10%马血清肉汤琼脂培养基上，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为:生长迟缓，为水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起，呈“煎蛋”样外观，菌落直径约0.2mm-2.0mm.6.4将可疑菌落或可疑肉汤培养物接种于普通10%马血清肉汤琼脂培养基，培养3d-4d，连传三代进行纯化，供病原鉴定用。7病

6、原鉴定7.1培养特性7.1.1挑取菌落接种10%马血清肉汤培养基中3d-5d后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原生长表现如6.3.2所述。7.1.2挑取菌落接种在普通10%马血清肉汤琼脂培养基上，3d-5d后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原生长表现如6.3.3所述。7.2染色镜检挑取典型菌落，涂于玻片上，自然干燥，用500铬酸水溶液固定2min，水洗，浸人用蒸馏水1:30稀释的姬姆萨氏染色液，4℃过夜，取出用蒸馏水轻轻冲洗，自然干燥后用800倍~1000倍显微镜观察。病原在显微镜下表现为多形态，以球形最常见，也可见杆状、丝状、环状、星状者，长度为125nm-250nm.7

7、.3生化试验挑取纯化菌落分别接种葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基和四氮哇盐生化培养基，37℃培养3d-5d后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原能分解葡萄糖产酸变色但不产气;不能分解精氨酸，试验管不变色;能还原四氮哇盐，培养基由无色变为红色。结果判定符合第7章所列条件的，判为牛传染性胸膜肺炎病原体。SN/T1376.附录A(规范性附录)培养基A.1运输培养基A.1.1培养基的成分:牛心浸液1000mL,酵母浸膏100g、琼脂3g、青霉素500000IU、乙酸花0.14g、马血清200mL,A.1.2培养基的配制:先将乙酸蛇溶于15mL的无菌蒸馏水中;牛心浸液中加人琼