SNT1166.1-2002-水泡性口炎补体结合试验操作规程.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1166.1-2002水泡性口炎补体结合试验操作规程Protocolofcomplementfixationtestforvesicularstomatitis2002一11一25发布2003一05一01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1166.1-2002HIJ舀水泡性口炎(VesicularStomatitis,VS)补体结合试验在参考国际兽疫局(OIE)(哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》和实践经验的基础上制定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位

2、:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:花群义、周晓黎、徐自忠。本标准系首次发布的检验检疫行业标准SN/T1166.1-2002水泡性口炎补体结合试验操作规程范围本标准规定了水泡性口炎补体结合试验方法。本标准适用于动物水泡性口炎病毒抗原检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过在标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO

3、3696:1987)缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1CF:补体结合试验。3.2CH;-50%补体溶血单位。33VSV:水泡性口炎病毒。3.4VSV-NJ:水泡性口炎病毒新泽西型;VSV-IND水泡性口炎病毒印地安那型。35VBD:巴比妥缓冲液。36PBS:磷酸盐缓冲液。4原理补体结合试验包括两个系统，第一系统为反应系统，即已知抗原(或抗体)，被检血清(或抗原)和补体。第二系统为指示系统(亦称溶血系统)，即溶血素加绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原一抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系统中的抗原和抗体是对应

4、的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加人指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系统中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素加绵羊红细胞免疫复合物激活，发生溶血，即阴性反应。5试剂和材料5.1溶血素:由指定单位提供。也可用50%的绵羊红细胞连续免疫家兔而获得兔抗绵羊红细胞血清，即溶血素。5.2补体:由指定单位提供。也可采集健康的公豚鼠血清,2只~3只豚鼠血清混合，分装成每小管1mL，置于一25℃以下低温冻结保存使用。5.32.8%绵羊红细胞悬液的制备:可直接购买保存于阿氏液中的绵羊红细胞。也可自行采血，保存于阿氏

5、液中。用前用冷VBD离心洗涤三次至上清液清亮。若三次离心仍不能使上清液清亮，则应更换新批号的红细胞。取离心沉淀的绵羊红细胞(按离心管上的刻度定即可)2.8MI，加97.2mL的VBD,SN/T1166.1-2002摇匀即成。5.4病毒;VSV-NJ和VSV-IND国际标准毒株，由指定单位提供。5.5标准阳性对照抗原和标准阴性抗原的制备:见附录A.5.6标准阳性血清:VSV-NJ和VSV-IND血清效价应达到1:16以上。由指定单位提供。5.7标准阴性血清:VSV-NJ和VSV-IND标准阳性血清互为阴性血清对照。由指定单位提供。5.8VBD稀释液:见附录A,5.9磷酸盐缓冲液(PBS):见

6、附录A,5.10水:符合GB/T6682-1992分析实验室二级水规格。6器械和设备分析天平、离心机、分光分度计、试剂瓶、高压灭菌器、干烤箱、超声波粉碎机、显微镜、微型振荡器、水浴锅、二氧化碳培养箱、冰箱(一25℃保存血清一70℃保存种毒)。96孔“U'，形底孔板，可调单孔道、多孔道微量移液器及滴头(20F}L-200川一)。刻度玻璃吸管等。水泡性口炎补体结合试验7.1试验准备7.1.1被检样品的处理:补体结合试验一般的检测对象是疑似感染VSV的细胞培养物、水泡皮、水泡液及喉头刮取液等，后三种样品要制成20%的悬液用于检测。水泡液可以直接使用，或用PBS做尽可能少量的稀释。水泡皮加玻璃砂研

7、磨，用PBS制成1:10和1:30的悬液(1:30作为补充试验之用，因为1，10悬液有时会出现抗补体现象)，以5000r/min(1000Xg)离心5min备用。若样品含毒量不高，比如样品不新鲜，则需通过细胞分离培养病毒，用于CF试验。7.1.2VSV-NJ和VSV-IND标准阳性血清做1:16稀释。7.1.31:16稀释的VSV-NJ和VSV-IND灭能阳性血清可互为阴性血清对照。7.1.4溶血素的滴定7.1.4.1溶