SNT1109-2002-新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程.pdf

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1、新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程Procedureofhaemagglutination—inhibitiontestforNewcastlediseaseSN／T1109—2002前言本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版)，并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册编写、制定。本标准的附录A、附录B为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡永强、单松华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围本标准规定了禽

2、类新城疫微量红细胞凝集抑制试验方法。本标准适用于禽类新城疫红细胞凝集抑制抗体水平的检测。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版)3仪器设备、试剂和材料所有试剂均为分析纯。3.1器材普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50μL可调移液器、恒温箱、塑料采血管等。3.2试剂磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸钠、蒸馏水。3.3稀释液p

3、H7.0或至pH7.40.01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录A标准的附录)。3.4新城疫标准抗原由指定单位供应，或用标准新城疫(ND)毒株尿囊腔接种9～11日龄无特定病原体(SPF)鸡胚，收集尿囊液灭活制备抗原。3.511%鸡红细胞采集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液(见附录B标准的附录)中，用20倍体积的PBS洗涤3～4次，每次以2000r／min离心3～4min，最后一次5min，用PBS配成1％悬液。4℃保存悬液，在72h内使用完。3.6血清3.6.1标准阳性／阴性血清：由指定单位供应。3.6.2被检

4、血清：采、送的样品。样品以1000r／min离心5min，吸出血清待用。若需较长时间保存血清，可置于4℃或—20℃。4操作方法4.1微量血凝试验(见表1)4.1.1在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μLPBS，共加四排。4.1.2吸取一定倍数稀释的抗原25μL加于第1列孔，充分混合后移出25μL至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25μL。4.1.3设立第12列孔为红细胞对照。4.1.4每孔再加25μLPBS。4.1.5每孔各加入1％鸡红细胞悬液25μL。4.1.6立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝

5、板绕圆圈混匀。4.1.7置37℃静置15min～20min，或室温(18℃～25℃)静置40min左右，或4℃静置60min(如果环境温度太高时)。4.1.8结果判定：期间观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀(此时为一个圆点)。将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果。HA效价高于211时可继续增加稀释的孔数。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度(红细胞无泪珠样流挂)，该血凝滴度代表了一个血凝单位，再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位。4.1.94个血凝单位的标定：根据4.1.8测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原

6、的稀释倍数。方法举例为：如抗原HA效价为27，其4个单位抗原HA效价为25，则将抗原稀释32倍即可。将25μL含4个血凝单位的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔(25μL)含有4、2、1、0.5个血凝单位，再加入1％鸡红细胞25μL，判定血凝图像与预期结果是否相符合。4、2、1个血凝单位孔红细胞应出现完全凝集，0.5个血凝单位孔红细胞应出现50％凝集。若不相符，须按4.1.1～4.1.8法重新进行。4.2微量血凝抑制试验(见表2)4.2.1在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μLPBS。4.2.2吸取被检血清25μL于第1列孔，混匀后

7、由左向右顺序倍比稀释至第12列孔，最后弃去25μL。4.2.3第1列孔至第12列孔分别加25pL含4个血凝单位的抗原。4.2.4立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.2.5在室温下，(18℃～25℃)至少感作30min，或在4℃至少感作60min。4.2.6每孔加1％鸡红细胞悬液25μL；混合后置室温下(18℃～25℃)40min左右，或在4℃60min(如果环境温度太高时)，此时对照的红细胞已沉淀为一个圆点。4.2.7每次测定须设已知滴度的阳性血清、阴性血清(SPF鸡血清)和红细胞对照(仅含25μLl%鸡红细胞和50μLPB

8、S)。4.2.8结果判定4.2.8.1检查各种对照。阴性血清血凝抑制滴度不得超过22，阳性血清血凝抑制滴度与已知滴度不得相