SNT1087-2002-牛Q热微量补体结合试验操作规程.pdf

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1、牛Q热微量补体结合试验操作规程ProcedureofmicrocomplementfixationtestforbovineQfeverSN/T1087—2002前言本标准按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》的要求，对原《中华人民共和国进出境动物检疫规程手册》(1997年12月)中的“牛Q热微量补体结合试验”进行修订。本标准的附录A是标准的附录。本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、广州出入境检验检疫局。本标准主要起草人：柯忠哲、朱世强、林志雄、张立怀、

2、范华炜。本标准系首次发表的检验检疫行业标准。1范围本标准规定了牛Q热微量补体结合试验的操作技术要求。本标准适用于牛、羊Q热微量补体结合试验抗体的检测，其他哺乳动物可以参照本标准。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3器材及试剂3.1器材3.1.1微量板：U型底96孔板。3.1.2加样器：8道5μL～50μL可调式移液器，10μL～750μL可调式移液器。3.1.3各种规格塑料滴头、刻度玻璃吸管、试管、试管

3、架。3.1.4离心机：低速，使用水平转子。3.1.5水浴锅：可调节温度。3.2试剂3.2.1抗原：按说明保存和使用。3.2.2标准抗原：按说明保存和使用。3.2.3标准阳性血清：按说明保存和使用。3.2.4标准阴性血清：按说明保存和使用。3.2.5被检血清：从被检动物静脉采血，分离血清，4℃保存。3.2.6补体：按说明保存和使用。3.2.7溶血素：按说明保存和使用。3.2.8试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。4预备试验4.12%绵羊红细胞悬液：采成年绵羊血，一份血加1.2倍量的阿氏液，混匀，4℃保存，5d后备用。使用前摇匀，取出10mL，用离心机以2000r/min离心5min，弃去上

4、清液，将下沉的红细胞泥用20倍量巴比妥缓冲液(VBD)洗涤，以2000r/min离心5min，重复洗涤三次，最后一次离心10min。取下沉的红细胞泥用VBD配制成2%(V/V)悬液。4.2溶血素效价的测定4.2.1溶血素的稀释：取溶血素0.1mL加VBD9.9mL混匀(如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素0.2mL加VBD9.8mL)，制成100倍稀释的溶血素，再按表1稀释成不同倍数。表1溶血素的稀释表123456789500100015002000250030004000500060001∶100溶血素/mL0.20.10.10.10.10.10.10.10.1VBD/mL0.80.91.41

5、.92.42.93.94.95.9总量/mL1.01.01.52.02.53.04.05.06.04.2.2补体的稀释：按表2对补体做不同倍数的稀释。表2补体的稀释表1234567892030405060708090100补体/mL0.10.050.050.050.050.050.050.050.05VBD/mL1.91.451.952.452.953.453.954.454.95总量/mL2.01.52.02.53.03.54.04.55.04.2.3致敏红细胞悬液的制备：将不同稀释度(1∶500～1∶6000)的溶血素与等量的2%红细胞悬液混合，置37℃水浴15min，为致敏红细胞。4.2

6、.4溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表3所示，1～9列为溶血素稀释度(1∶500～1∶6000)，A～H行为补体稀释度(1∶30～1∶100)。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液50μL，分别滴加于1～9列的各孔中。吸取不同稀释度的补体50μL，分别滴于A～H行各孔中，每孔再加25μLVBD，滴加完毕后，置微量振荡器上混匀，随后置37℃温箱中感作30min后进行初判，置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。4.2.5溶血素效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，在最小量的补体存在下，能使90%红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血

7、素，测定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表3的测定结果为，补体在1∶70稀释时，发生90%溶血的最少溶血素为1∶4000，该1∶4000为一个单位溶血素。两个单位溶血素为1∶2000。表3溶血素效价滴定判定举例表1234567891∶5001∶10001∶15001∶20001∶25001∶30001∶40001∶50001∶60001∶30———————++1∶40———————++1∶