肺癌患者血管内皮生长因子的检测和意义-(8201)

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1、肺癌患者血管内皮生长因子的检测和意义前言肿瘤细胞分泌的通透因子VEGF可导致毛细血管通透性的增加，使胸液的形成超过吸收，形成积液，近年来研究表明，胸液VEGF在恶性胸液中明显高于良性胸液，对于恶性胸液的诊断，有一定灵敏度及特异性，联合其它胸液指标检测，更能提高鉴别诊断效能，因而是一项有价值的辅助诊断方法。总之，进行VEGF在肺癌中的检测，有一定的临床意义。目前国内外同时进行VEGF在肺癌患者组织及对应血清中的检测报道还不多，进行胸液VEGF联合其它指标检测，亦是近几年才兴起。本研究旨在应用免疫组化SP

2、法及ELISA法检测VEGF在肺癌组织及对应血清中的表达，并检测VEGF、CEA在恶性胸液中的水平，探讨VEGF在肺癌中的临床意义，为肺癌的治疗提供一定的理论依据。2肺癌患者血管内皮生长因子的检测和意义第一部分第一部分非小细胞肺癌组织中血管内皮生长因子的表达和意义材料一、临床资料选用2000年3月至2001年3月手术切除并经病理学确诊的非小细胞肺癌(NSCLC)标本46例，其中男35例，女11例。年龄31—75岁，平均56岁。按WHO《肺肿瘤组织学分型》(198l>标准包括肺腺癌21例，肺鳞癌25例。

3、组织学分级为高分化5例、中分化24例、低分化l7例。按国际抗癌联盟UICC(1997))]市癌分期标准包括I期17例、II期3例、IlI期22例、Ⅳ期4例。有淋巴结转移22例，无淋巴结转移24例。46例中4l例有完整随访资料。另选20例相应癌旁组织(距癌灶边缘>3cm)标本作对照。二、主要试剂鼠抗人VEGF单克隆抗体(Maxim公司)，鼠抗人CD34单克隆抗体(Maxim公司)，链霉菌抗生物素蛋白．过氧化物酶(SP)免疫组化试剂盒，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购至福建迈新生物技术公司。三、主要仪

4、器和设备轮转式组织切片机(30l一268型德国)，生物医学微波炉(LD—III型R本)，病理组织漂烘处理仪(PHY-III型国产)，恒温培养箱(MIRl60／MIR260日本)，电热鼓风干燥箱(cs一101．3型国产)，奥林巴斯生物显微镜(BHS型曰本)。方法一、免疫组织化学染色法采用微波修复S-P染色技术，进行VEGF在NSCLC组织及癌旁组织的免疫组化标记，具体操作步骤如下：肺癌患者血管内皮生长因子的检测和意义第一部分(1)蜡块常规切片4um连续多张，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，常规烘片脱蜡，梯

5、度酒精到蒸溜水化。(2)加O．3％H202液(A液)封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟。(3)蒸溜水洗涤3次，每次2分钟，将切片放入煮沸的O．01M，PH6．0枸橼酸缓冲液中，4档下继续加热lO分钟，使掩蔽的抗原得以修复。(4)取出切片，冷却至常温，PBS液漂洗3次，每次5分钟。(5)每张切片滴加O．1％胰蛋白酶20ul消化，37。C孵箱内孵育35分钟，使细胞内抗原显示出来。(6)蒸溜水冲洗，PBS液浸泡3次，每次5分钟。(7)每张切片加正常非免疫动物血清(B液)，以阻断组织中的非特异性吸附，室温

6、10分钟。(81滴加一抗VEGF，在4℃冰箱过夜。(9)PBS液漂洗3次，每次5分钟，加入生物素标记的二抗(C液)，室温30分钟。(10)PBS液漂洗3次，每次5分钟，加入链霉菌抗生物素蛋白．过氧化物酶溶液(D液)，室温30分钟。(11)PBS液漂洗3次，每次5分钟，新鲜配制的DAB显色液显色彩lO分钟，显微镜下控制，蒸溜水冲洗。(12)苏木素染色片刻，梯度酒精脱水，室温下干燥，中性树胶封片。二、结果判定每批染色用已知阳性标本作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。(1)VEGF阳性：于免疫染色最

7、多的区域计数1000个肺癌细胞，以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评估。染色强度评分：细胞无染色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分：阳性细胞百分率评分：无阳性细胞0分，<25％1分，25％～50％2分，>50％3分：两者相加，0,-．2分视为阴性，3—6分视为阳性。(2)微血管密度(MVD)NI]定：应用CMIAS病理彩色图像分析系统测定。参照Weider方法【l】，先在低倍镜(×40)下扫视整个切片，确定3个高血管密度区，即“热点”，再在高倍镜(×200)下记数被染成黄色的微血管数目，结

8、果用3个高倍镜视野下微血管数目的平均数来表示。4肺癌患者血管内皮生长因子的检测和意义第一部分三、统计学处理采用SPSSl2，0统计分析软件对结果进行分析，计量资料以x+s表示，均数比较用f检验，计数资料用穿检验；VEGF和MVD的相关性用Spearman等级相关分析。累积生存率用Kaplan—Meier方法统计，并用log．rank进行显著性检验。结果一、VEGF在NSCLC及癌旁组织中的表达VEGF阳性染色主要位于NSCLC的胞浆中，胞浆被染成棕黄色。