SCT3024-2004-腹泻性贝类毒素的测定生物法.pdf

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1、ICS67.050B50Sc中华人民共和国水产行业标准SC/T3024-2004腹泻性贝类毒素的测定生物法DeterminationofdiarrhoeashellfishpoisonBioassay2004一01一07发布2004一03一01实施中华人民共和国农业部发布SCAT3024-2004ou青本标准参考了日本厚生省推荐使用的腹泻性贝类毒素的测定方法。本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：国家水产品质量监督检验中心、中国水产科学研究院东海水产研究所。本标准主要起草人：王联珠、袁骥、李晓川、冷凯良、陈亚瞿、蒋

2、玫。SCAT3024-2004腹泻性贝类毒素的测定生物法1范围本标准规定了腹泻性贝类毒素（DSP）的测定方法—生物法。本标准适用于软体动物贝类可食部分中腹泻性贝类毒素（DSP)的测定。2原理用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后，再以1％吐温-60生理盐水溶解残留物，注射小鼠，观察存活情况，计算其毒力。3试剂和材料QI︺丙酮（分析纯）。QC／口J乙醚（分析纯）。Qq口口1％吐温一60生理盐水：称取1.0g吐温-60，溶于生理盐水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL.4仪器和设备4.1旋转蒸发器。4.2均质器。4.3磨口烧瓶：圆底

3、，500mL,100mLo4.4布氏漏斗：0100二。4.5分液漏斗：具塞，500mLo4.6天平：感量0.1go4.7刻度试管：10mL，具塞。4.8冰箱：0℃一5℃和一15℃一一20`C。4.9注射器：1mLo4.10注射器针头：8#。4.11小鼠：体重为16g--20g的健康1Clx系雄性小鼠。5检样的制备5.1生鲜带壳的贝类a)用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体；b)收集贝肉，沥水5min，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻，贮藏备用；c）注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，

4、组织呈暗绿色或褐绿色）。开壳前不能加热或用麻醉剂。5.2冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻状态，按5.1方法清洗、开壳、淋洗、SC/T3024-2004取肉。5.3取样a)可以切取中肠腺的贝类（扇贝、贻贝、牡a等），称取200g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切混合作为检样，注意不要使中肠内容物污染案板；b)对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，作为检样；c)为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5％的次氮酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也

5、应用5％的次氯酸钠溶液处理。6提取6.1取5.3a）处理的中肠腺，或5.3b)处理的200g贝肉置于均质杯内，均质2min.6.2加3倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液。6.3将抽提液移人500mL的磨口烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，56r-）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物。6.4将浓缩液移入分液漏斗内，以100ml--200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡（不能生成乳浊液），静置分层后，去除水层（下层），用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移人250ml、的

6、磨口烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，35`C）去除乙醚。6.5以少量乙醚将浓缩物移入100ml.磨口烧瓶中，再次减压浓缩去除乙醚。6.6以1％吐温-60生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10mL。此时1ml、试液相当于20g去壳贝肉的重量，以此悬浮液作为试验原液。6.7以试验原液注射小鼠，24h内3只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射小鼠。稀释前，应先振荡使溶液成均匀悬浮液，再取部分试液以1％吐温-60生理盐水稀释。7小鼠试验，口．了．以振荡器使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液。7门了／﹄将每只小鼠称重，每三只小鼠为一组，分别将1mL试液注射到小鼠

7、腹腔中。下八0了同时，另取三只小鼠作为对照组，注射1mL1％吐温-60生理盐水于腹腔中。了了观察自注射开始到24h后的小鼠存活情况，求出一组三只中死亡两只及两只以上的最小注射量。7.5小鼠注射腹泻性贝毒后的症状为运动不活泼，大多呼吸异常，致死时间长。8结果计算和表述8.1毒力的计算使体重16g-20g的小鼠在24h死亡的毒力为1个小鼠单位（MU)o样品中DSP毒力的计算，按表1选择24h内死亡两只及两只以上鼠的最小注射量及最大稀释倍数进行计算。8.2注射里与毒力的关系注射量与毒力的关系见表10sc/T3024-2004表t注射里与毒力的关系注射量检样量“

8、毒力试验液9mLMU/g－20原液10原液切2倍稀释液52倍稀释液54倍稀释液4