【硕士论文】白藜芦醇对培养的人黑素细胞的影响.pdf

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1、汕头大学医学院硕士学位论文：白藜芦醇对培养的人黑素细胞的影响摘要近年来，随着人口老化、环境污染、全球气温上升，越来越多的人出现皮肤色素失调性疾病。寻找更安全、更有效的新型外用皮肤美白祛斑剂是当今化妆品的研究热点之一。细胞因子与黑素细胞之间的关系已成为美白研究的另一重要方向。在皮肤，内皮素(endothelins,ET)表达于角质形成细胞，内皮素受体(endothelinreceptor,EDNR)则表达于黑素细胞。已证实，ET可与黑素细胞膜上的内皮素受体相互作用并通过酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinase-relatedprotein-1,TRP-1）、MA

2、PK、PKC、PKA和酪氨酸激酶受体（receptortyrosinekinase，KIT）这六条信号通路促进黑素细胞的增殖和黑素生成。因此，内皮素系统作为角质形成细胞和黑素细胞相互作用的桥梁，参与黑素细胞的增殖和黑素合成等过程，而内皮素拮抗剂可以通过拮抗ET的作用而抑制黑素细胞增殖及合成黑素。已有报道证实白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种非肽类内皮素拮抗剂。我们推测，RES作为一种内皮素拮抗剂可能从酪氨酸酶、TRP-1、MAPK、PKC、PKA和KIT这六条信号通路拮抗ET-1诱导的黑色素生成，从而达到美白祛斑的作用。本课题主要目的是研究RES对ET-1介

3、导的黑素细胞黑素合成的影响及其相关机制，并探讨其对黑素细胞的细胞毒性作用，为RES作为一种新型、安全和高效的皮肤美白祛斑物质提供一定的理论基础和实验依据。为了使该项研究顺利地完成，我们将整个实验细分为四个实验，分别是：①建立不含佛波醇酯（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA）和霍乱毒素（choleratoxin,CT）体外培养正常人黑素细胞的方法：以避免TPA和CT改变黑素细胞的生物学特性，为后续的实验提供可靠的黑素细胞来源。②研究ET-1对培养的人黑素细胞生物学特性的影响：探讨ET-1对体外培养的正常人黑素细胞形态、增殖、酪

4、氨酸酶活性及黑素合成的影响，并寻找一个最有效的调控浓度，为后续的实验提供实验基础。③RES对人黑素细胞的细胞毒性分析：以探讨RES应用于美白祛斑治疗的安全性，并寻找出其安全浓度范围，为其临床应用提供实验依据。④探讨RES对ET-1介导的黑素合成的影响及其相关机制：以探讨RES应用于美白祛斑治疗的有效性，并初步研究其相关机制，为其临床应用提供实验依据。针对以上四个IV汕头大学医学院硕士学位论文：白藜芦醇对培养的人黑素细胞的影响实验目的，我们的实验方法和结果如下：首先，在第一项实验研究中，我们取了青少年包皮环切术后包皮组织6例，年龄6-11岁，平均8岁，用不含TPA和CT的角

5、质形成细胞无血清培养基（KC-SFM）培养、用差速贴壁法及胰酶差速消化法去除角质形成细胞、用两段法去除成纤维细胞，所培养出的细胞经多巴染色和抗S-100、抗HMB45蛋白抗体免疫细胞化学染色均呈阳性反应，证实为黑素细胞，从而建立了不含TPA和CT体外培养正常人黑素细胞的方法，该方法稳定、可靠。其次，在第二项实验研究中，我们取了青少年包皮环切术后包皮组织6例，年龄6-15岁，平均11岁，分别用倒置显微镜观察、CCK-8法、多巴氧化法和NaOH法测定了ET-1对黑素细胞形态、增殖、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。该项实验结果提示：一定浓度的ET-1可有效地促进培养的正常人黑素细

6、胞的增殖和树突形成，上调酪氨酸酶活性和增加黑素含量，10nM的ET-1不仅能促进黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性，而且此浓度下的黑素含量水平最高，因此10nM是最有效的调控浓度。再次，在分析RES对人黑素细胞的细胞毒性作用时，我们取了青少年包皮环切术后包皮组织3例，年龄6-12岁，平均10岁，用CCK-8法测定黑素细胞的增殖抑制率，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测黑素细胞的凋亡率。该项实验结果显示，10µM浓度以下的RES对人黑素细胞无增殖抑制作用也无凋亡促进作用。最后，在研究RES对ET-1介导的黑素合成的影响及其相关机制中，我们取了青少年包皮环切术后包皮组织9例

7、，年龄6-15岁，平均12岁，采用NaOH法测定黑素含量，多巴氧化法测定黑素细胞的酪氨酸酶活性，半定量RT-PCR法测定酪氨酸酶mRNA和TRP-1mRNA表达水平。我们的实验结果提示：0.1~10µM的RES可抑制ET-1介导的黑素合成，其主要机制可能是通过抑制酪氨酸酶活性起作用，而与酪氨酸酶mRNA和TRP-1mRNA的表达无关。我们的实验结果表明，RES可作为一种内皮素拮抗剂，可以通过抑制酪氨酸酶活性减少黑素合成，且在10µM浓度以下时无细胞毒性作用。因此，RES可作为一种皮肤美白物质，其安全、有效的浓度范围是0.1~1