油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因初步的分析

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1、四川大学硕士学位论文声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师王茂林副教授指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了中文特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的研究材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。导师野≥翻导师签字劫制——研究生签字：同噌四川大学硕士学位论文油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分

2、析专业遗传学研究生：周增光导师：王茂林教授摘要“NDF．1”是利用快中子轰击及硫酸二乙酯(DES)联合处理甘蓝型油菜高秆品系，然后再自交纯合后育成的矮化突变体，其株高仅及亲本的三分之一。“NDF．1”在油菜抗倒伏及半矮秆杂交种选育中具有重要的作用。本文应用抑制性消减杂交(suppressionsubtraetivehybridization,SSH)技术构建了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF．1”茎段伸长初期的抑制性消减文库，对差异表达基因进行分析，为探究油菜矮化突变的分子机理及克隆该基因应用于油菜品种基因工程改良奠定基础。首先，应用SSH技术，以矮

3、秆突变株系“NDF．1”为Tester、高秆野生型。3529”为Driver，构建了甘蓝型油菜矮化突变体。NDF．1”茎段伸长初期茎尖的抑制性消减文库。经菌落PCR检测，消减文库的有效重组率为58％，其中插入的eDNA片段大小在100bp到500bp之间。通过斑点杂交对88个随机挑选的含有插入片段的阳性克隆进行初步差异筛选，然后选取了30个阳性克隆进行序列测定。除7个克隆未出现测序结果外，其余克隆均获得了DNA序列结果。对eDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比较。其中13个有比较明确的比对结果：其中1个和信号转导有关，2个和植物抗病性有

4、关，1个和蛋白质的泛素化降解有关，1个和脂肪酸转运有关；另外有8个克隆为功能未知的蛋白质。其次，在SSH文库克隆序列分析的基础上，以甘蓝型油菜(Brassicanapus)矮化突变体“NDF．1”茎尖为材料提取RNA，采用RACE技术对编码几丁质酶基因的G6克隆的3’端片段进行了RACE扩增，获得3’端片段序列长度为344bp，在GenBank中进行比对(blast)分析。结果表明，与几丁质酶基因核苷酸和蛋四川大学硕士学位论文白质同源性分别为86％和84％。根据G6克隆的己知序列设计特异引物并应用逆转录合成的eDNA和PCR技术，检测其在野生型与

5、矮化突变体不同部位的差异表达。结果显示，该基因仅在矮化突变体茎尖部位有比较明显的表达；在矮化突变体根、茎、子叶和成熟叶片部位无表达：在野生型根、茎、茎尖、子叶和成熟叶片等部位均无表达或无明显表达。初步结果表明，该仅在茎尖表达的基因很可能和矮化突变体的矮化有关。为了进一步研究该基因在甘蓝型油菜茎秆发育中的作用及参与矮化形成的具体机理，还有待克隆其eDNA全长，通过遗传转化分析其在矮化突变体中的功能。关键词：甘蓝型油菜，矮化，抑制性消减杂交，半定量RT—PCR，差异表达，RACE2四川大学硕士学位论文PrimaryAnalysisofthediffe

6、rentiallyexpressedgenesintheshootapicalmeristematthebeginningofthestemelongationintheDwarfMutant‘NDF-1’Major：GeneticsMaster：ZhouZeng-guangSupervisor：Prof．WangMao·linAbstract11”line‘'NDF一1”，whichisadwarfmutant，hasbeenobrainedfromthedoubledhaploidBrassicanapusinbredline3529indu

7、cedbv纽stneutronanddiethylsulfate(DES)，whoseheightisone血iIdofmatofthewildtype．T1le1eavesofthe‘'NDF一1”mutantalewrinkledandthickcomparedwiththoseofthewild-typecontr01．andwaneearlierthanthoseof也ewildness．Thesubtractionlibraryofdwarfmutant‘'NDF．1”anditswildtype3529wasconstructedby

8、suppressionsubtraetivehybridization(SSH)．Inthesubtraction,thecDNAsfr