【硕士论文】αsynuclein蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制.pdf

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1、u-synuclein蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制摘要酪氨酸酶(EC．1．14．18．1)是一种广泛存在于自然界中含铜的金属氧化酶，它具有单酚酶活性，可以将酪氨酸羟化形成L．多巴(L．DOPA)，也具有二酚酶活力，将L．多巴氧化成多巴醌。它是生物形成黑色素合成的关键酶，决定了皮肤和头发色素的颜色。酪氨酸酶的异常表达引起了各种各样的皮肤病，如老年斑及光照损伤等。它还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病有关，因此酪氨酸酶抑制剂临床应用于与黑色素失调相关疾病的治疗。其在美白化妆品及日晒变黑应用方面具有重要作用。本论文从天

2、然植物中分离纯化出对酪氨酸酶具有很强抑制作用的抑制剂并探讨其对单酚酶和二酚酶活性的抑制作用机理。再以小鼠B16F10细胞的酪氨酸酶为研究对象，研究其对黑色素生成量的影响及其相关基因的转录调控机制。最后，以果蝇为动物模型研究酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶代谢途径中相关产物多巴胺生成量的影响。在筛选酪氨酸酶抑制剂过程中，发现了与帕金森病相关的a．synuclein蛋白的过表达能显著抑制黑色素的生成量，这预示着酪氨酸酶与帕金森病可能有着某种相关性，因此研究了0【．synuclein蛋白对小鼠B16F10细胞酪氨酸酶转录调控’的机制。相关研究内容和结

3、果如下：(1)对酪氨酸酶有抑制作用的化合物：Cardoltrienes，Cardoldiene，Cardnoltrienes，Cardanoldiene，Cardanolmonone，研究了它们对对酪氨酸酶的抑制机理及对小鼠B16F10细胞的黑色素生成量的影响及其相关基因的转录调控机制。(2)从抗生素药品中筛选了对酪氨酸酶有制作用的药物，研究其对酪氨酸酶的抑制机理。(3)以果蝇为动物模型研究酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶代谢途径中相关物质含量的影响。(4)研究了a．synuclein蛋白过表达对小鼠B16F10细胞的酪氨酸酶转录调控的机制。关

4、键词：酪氨酸酶；抑制剂；作用机理；0t-synuclein蛋白；黑色素形成调控Ⅱ{yn眦lem蛋自盈抑制剂对薛氟醋的调控机锗1前言1．1酪氨琏酶1．1．1概述酪氨酸酶(EC．J14．18．1)是一种广泛存在于自然界中含铜的会属氧化酶，它具有单酚酶活性，可以将酪氨酸羟化形成L·多巴(L-DOPA)，也具有二酚酶活力，将L一多巴氧化成多巴醌¨】．是生物形成黑色素合成的关键酶，它决定了皮肤和头发色素的颜色酪氨酸酶的异常表达引起了各种各样的皮肤病，如老年斑及光照损伤等，它还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病有关吐因此酪氨酸酶

5、抑制剂l简末应用于与黑色素失调相关疾病的治疗131且在美白化妆品及日晒变黑应用方面具有重要作用14．”。酪氨酸酶抑制剂成了被广泛研究的课胚⋯ol。一些药物对氨酸酶的作用已有文献报导，如治疗高血压和心衰药物卡托普利和抗甲状腺药物甲巯基眯唑都是酪氨酸酶抑制剂【n．121。1．1．2酪每酸酶的三维结构酪氨酸酶是_种疏水性的膜结合蛋白。酪氨酸酶属于Ⅲ型铜蛋白家族，在催化反应过程中，其铜离子中心存在三种不状态㈣，它的活性中心含有双铜离子．可以可逆的与氧结合114．1

6、51。虽然Ⅲ型铜蛋白家族结构有很多文献报导【16-221，但直到2006年，Ma

7、toba等口31在大肠杆菌表达酪氨酸酶和ORF378蛋白，得到了酪氨酸酶与ORF378蛋白共结晶及结构模型(见图I)。图I酪氨酸酶的晶体结构红色代表酪氨酸酶．蓝色代表ORF378FigIOverallSh‘‘JctureoflyrosimlsecomplexedwithORF378a．synuclein蛋自厦抑制剂对醋鲺酸酶的调控机制酪氨酸酶是由7个q-螺旋和一些B-折叠组成，4个u．螺旋位于蛋白的核心(以、a3、ct6、a7)，酶活性中心则位于a一螺旋中。活性中心cuA分别与Hi％8、Hiss4和His∞形成配位键，CuB分别与His

8、l90、HisI*和His216形成配位键。除了Hi％4，铜离子的His配体均来自于螺旋a2、d3、a6和订，并且His*没有与硫原子形成类似于儿荼酚氧化酶活性中心的硫醚键，所以Hiss。易变动，而导致CuA比CuB易于变动。酶双铜活性中心位于由疏水氨基酸残基组成的口袋的底部。ORF378蛋白是位于酪氨酸酶表面的载体蛋白，可以协助铜离子插入酪氨酸酶的活性rfl心，从而使酪氨酸酶具有活性。研究表明，酪氨酸酶与ORF378的结合态足酪氨酸酶在活化前的中『BJ态。酪氨酸酶的活性中心接近酶蛋白分子表面(见图II)1231，有利于底物与酶活性中心

9、结合。^刿1I酪氨醴酶(^)剌0RF378分子表而结构FigrIMolecularsurfacesoftyTosinase(A)and0RF378(B)酪氨酸酶的活性中心山两个古铜离子位点构成㈣。在催化过程