水禽源新城疫病毒经鸡传代后hn蛋白变异的研究

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1、扬州大学硕士学位论文水禽源新城疫病毒经鸡传代后HN蛋白变异的研究姓名：艾静申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：丁铲20070501扬州大学硕上学位论文6龃AmpBSADNAE】Ⅵ．AFHAHNICPIIPTGIVPILMMDTNDNDVNpPPEGRNART．PCRSDSSPFX—gaI符号说明aminoacidampicillinbovineserBmalbumindeoxydibonucleieacidEthylenediaminetetraaceficacidfusionproteinhemagglutina

2、tionhemagglutinin-neuraminidaseproteinintracerebralpathogenicityindexisopropyl—B—D-thiogalaetosideintravenouspathogenicityindexlargeproteinmatrixproteinmeandeathtimenewcastlediseasenewcastlediseasevirusnucleocapsidproteinphosphateproteinpolyethyeneglycolribonuclei

3、cacidreversetranscription-polymerasechainsodiumdodecylsulfatespeeificpathogenfree氨基酸氨苄青霉素牛血清白蛋白脱氧核糖核酸乙二胺四乙酸融合蛋白血凝实验血凝素．神经氨酸酶蛋自脑内接种致病指数异丙基硫代半乳糖苷静脉接种致病指数高分子量的RNA聚合酶基质蛋白最小致死量平均死亡时间新城疫新城疫病毒核衣壳蛋白磷蛋白聚乙二醇核糖核酸反转录一聚合酶链反应十二烷基磺酸钠无特定病原体5一bromo-4·chloro·3一indolyl·8·D—galactosi

4、de5-溴4氯．3一吲n朵-蹦D-半乳踣苷扬州人学硕1：学位论空水禽源新城疫病毒经鸡传代后HN蛋白变异的研究研究生：艾静导师：丁铲研究员摘要新城疫(ND)是一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡和火鸡，亦可感染其它禽类、鸟类和人。国际兽医局(O伍CeIntemationdesEpizooties，OIE)将其与高致病性禽流感同列为危害养禽业的必须报告的疫病，因此世界各国对本病的发生和流行均高度重视，在许多发达国家己消灭了本病。新城疫病毒(NDV)只有一种血清型，但不同毒株之间的毒力和致病性差异很大。在世界上曾有过三次大流行

5、，其中两次源于鹦鹉和鸽，其它禽类由来的NDV在易感动物鸡体中连续传代后毒力增强的可能性很高。我们在前期研究工作中进行了NDV无毒株在鸡体内传代的工作，即将从野生水禽的新鲜粪便中分离得到的无毒株Goose／Alaska／415／91经9代次的雏鸡气囊接种传代(9a)和5代次雏鸡脑内接种传代(5b)，分析每次传代后分离株的毒力和分子结构变化，结果表明无毒株演变成了强毒株。F蛋白的基因序列分析结果表明，原代病毒无毒株的F蛋白裂解部位112—117位氨基酸序列具有典型的弱毒株模式，即ERQER．L，而经过14次的传代则演化成典型的

6、强毒特征，即KRQKR-F。最近的研究表明：HN基因也被认为在NDV感染过程中起着重要的作用。在根据NDV基因的核苷酸和氨基酸序列对NDV分离株进行致病性分类时发现I-IN和F基因的变异具有很强的正相关性。在我们的前期研究工作中重点是放在原代病毒和继代病毒的F蛋白裂解位点的突变株与致病性演化的关系上，结果表明：病毒在逐渐获得致病性的同时，F蛋白基因发生着相应的变异。而HN基因的变异与NDV致病性的关系以及I-IN蛋白的变异规律正是本实验的研究重点。本实验以原代病毒及其继代共15代次病毒为研究材料，进行部分生物学活性的检测，

7、针对实验获得的15个NDVHN全基因的克隆进行测序与氨基酸序列的分监静：水禽源新城瘦旃毒经鸡传代后HN蛋白变异的研究析．研究HN基因的变异规律，对于NDV的致病性分子基础提出新的理论依据。在实验中将15代NDV分离株分别接种鸡胚尿囊液进行增殖病毒，提取病毒基因组总RNA，进行RT-PCR扩增I-IN基因，克隆入pGEM-T载体后，经蓝白斑筛选，酶切鉴定，阳性克隆进行测序分析。经过序列比对分析15代分离株的I-IN基因发现：经过在气囊传两代后，自2a(气囊传代2次)代起HN蛋白1717位碱基G突变为T，导致终止密码子由186

8、4TAAl866提前至1717TAGⅢ9，这使得HN蛋白从616个氨基酸(aa)缩减为572aa，即少了一个44aa的尾，且一直保持到9aSb(气囊传代9次，再在脑内传代5次)代病毒。HN蛋白中糖基化位点、参与蛋白二聚体形成的半胱氨酸残基均未发生改变。实验结果表明，I-IN蛋白只要在气囊传代2次，就能达