临床检验中发光免疫

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1、临床检验中的发光免疫分析原理、优势和值得注意的问题北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会(ISBC）学术理事CouncilmemberofscientificadvisoryboardofInternationalSocietyonBioluminescence&Chemiluminescence杨晓林由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。与荧光最大的区别在于无需激发光，因此后

2、者也被称为光致发光。发光（Luminescence）化学发光（Chemiluminescence）生物发光（Bioluminescence）生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于发光体温度升高所致，因此其反应能量绝大部分用于发光而不是发热，发射波长也与温度无关。发光测定属发射光谱分析，多采用动力/速率法或积分法，无需终止反应，也不受朗伯-比尔定律限制；而酶标显色测定属吸收光谱分析，多采用终点法，需终止反应，并受朗伯-比尔定律限制。按化学反应类型化学发光的分类酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统

3、黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统闪光（Flash）:按发光持续时间发光时间在数十分钟以上，如：HRP-Luminol系统AP-AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(InSituInjector)和时间积分法测量辉光（Glow）:时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰闪光与辉光及其测量方式的差别鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统H2O2+NH2OONHNHN2OH-HRPNH2CO2-CO2-+Pho

4、ton(425nm)ROHROHNSRBOHOH增强剂（Enhancer）商业化产品中常见的化学发光系统（一）AMPPD及其衍生物的化学发光系统+*光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3OO-OOCH3商业化产品中常见的化学发光系统（二）CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商业化产品中常见的化学发光系统（三）吖啶酯化学发光系统发光检测的剂量--反应关系曲线信号强度（Y）实际曲线标记物

5、浓度（X）理论/校正曲线由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）结构简单、性能稳定但灵敏度低、线性范围较窄。主要特点原理：光信号光电转换器件电压或电流信号放大单光子计数器是目前高灵敏度发光分析仪的核心部件光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU)在各打拿极之间得到能量和数目的倍增单光子计数器的工

6、作特性光子计数（Y）发光强度（X）饱和点理论/校正曲线实际计数曲线由于：单光子计数是在检测随机光子事件因此：随光子数量增多检测效率持续下降所以：准确的校正技术是设备品质的关键模拟（光电流）测量曲线单光子计数式发光检测仪计算机打印机发光仪控制模块发光仪执行模块控制器程控高压计数/贮存器单光子计数器样品运动/定位装置程控自动门锁及检测装置原位注射泵光生物学技术的应用范围军事侦测公安稽查卫生检疫药物筛查医学诊断环境检测航天遥感生命科学……已成为现代生物技术最活跃的领域之一光生物学检测技术的优越性彻底消除了放射性危害无

7、半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长容易实现连续、动态、重复测定适合于复合标记系统进行多指标并行测定操作简单，反应速度快，容易实现自动化灵敏度和线性范围超过以往技术几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9几种标记/检测技术理论线性范围的比较酶标荧光放免发光线性范围105104103102几种标记/检测试剂的有效期比较酶标荧光放免发光有效期（月）1815129630020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒仪器特

8、殊防护治理污染人民币人民币三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用放免酶标发光夹心法的剂量--反应关系曲线信号强度（Y）线性范围待测物浓度（X）Hook(前滞)效应分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。功能灵敏度：测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。线性范围：（分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度相关系数≥0.