人血管内皮生长因子（hvegf_2c165_）融合蛋白的表达纯化

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1、分别进行SDS．PAGE和Weestnblot分析。确定表达后对诱导条件进行优化，并确定融合蛋白表达部位。其后大量诱导VEGFl65融合蛋白表达，收集、洗涤包涵体，以8mol／L尿素溶解后复性，将复性液经过HisPrepFF16／10亲和层析柱以亲和层析的方法获得纯化的VEGFl65融合蛋白。结果：重组表达质粒pET-15b／VEGFl65经特异的双酶切鉴定结果提示，各酶切片段实际大小与理论大小基本一致。测序结果也表明，重组表达质粒中VEGFl65目的基因片段的核苷酸序列完全正确，阅读框架无误，重组表达质粒构建成功。表达工程菌诱导表达产物的SDS

2、．PAGE分析表明，诱导表达产物中均有相应的VEGFl65重组融合蛋白表达，其表达水平较高，并为包涵体表达。进一步的经Westernblot鉴定结果显示，VEGFl65重组融合蛋白能与VEGF多克隆抗体特异结合，确实为我们要表达的目的蛋白。确定了最适宜的表达条件为：0．5mmol／LIPTG，37℃，诱导时间4~5h。表达产物经HisPrepFF16／10亲和层析柱亲和层析可分离纯化得VEGFl65融合蛋白。结论：本实验成功构建了VEGFl65基因的原核表达载体，克隆的VEGFl65基因在E．coliBL-21(DE3)qb得到了稳定表达，并分离

3、纯化得高纯度的VEGFl65重组融合蛋白。pET-15b／VEGFl65原核表达载体的构建和诱导表达及分离纯化的成功，为下一步大量制备VEGFl65目的蛋白，研制vEGF单克隆抗体，及研究其抗肿瘤作用奠定了基础。关键词：VEGF基因原核表达基因克隆蛋白表达亲和层析2E‘，lrificationof’vascularendothelialExpressionpurificationolIIIImanvascUlarenotllellal，growthfactor165(VEGFl6s)fusionproteinAbstractobjective：M

4、alignanttumorhasgalacticdetrimenttopeople’Shealth．Anditsattackrateisadscendentyearbyyear．Tumorgrowthandmetastasislargelydependonangiogenesisandthevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)playacriticalroleintumor-associatedangiogenesis．SoifinhibitthesignaltransductionofVEGFmayinhi

5、bitangiogenesis，thatmayinhibittumorgrowthandmetastasis．WeplantoconstruetheinducibleHis—VEGFl65recombinantprokaryoticexpressionvectors，andinducethetargetrecombinantfusionproteinstoexpressincertainconditions．ThestudyofnextphasesuchaspreparingandpurifyingtheVEGFl65targetproteins

6、onalargescale，inoculatinganimals，obtaintingalotofmonoclonalantibodiesofVEGFl65，andstydytheanti—tumoreffectofmonoclonalantibodiesofVEGFl6s，wouldbebuiltontheseworks．methods：TheprimersWasdesignedaccordingtothesequenecharactersoftheVEGF165eDNAandmultiplecloningsitesofpET-15bprola

7、ryoticexpressionvector．ThetargetgenefragmentofVEGF,VEGFl65full—lengthfragment(576bp)，WasamplifiedbyRT-PCRfromthetissuetotalRNAofColorectalCancer．ThetargetgenefragmentofVEGFl65wasrecoveredandpurifiedfromlowmeltingpointagarosegels．ThepET-15bvectorWastransfoITlledintothecompeten

8、tEscherichiacoliDH5Q，andthenbepreparedonasmallscalebyalkalinelysisme