cm4-hsbaff基因在大肠杆菌中表达及生物学活性的研究

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1、南京师范大学硕士学位论文CM4-hsBAFF基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性研究姓名：刘海峰申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张双全;刘平20080101中文摘要摘要抗菌肽是生物细胞体内特定基因编码的一类小分子多肽，也是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障，其生成和释放是机体炎症反应的重要组成部分。抗菌肽CM4不仅对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌有高效广谱的杀菌能力，而且对某些病毒、真菌和原虫也具有抑杀作用；同时它还●．对某些肿瘤细胞具有选择性的杀伤作用，而对正常哺乳动物和昆虫的细胞

2、却无明显的抑杀作用。B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是肿瘤坏死因子(n旺)超家族的成员，BAFF对活化的B细胞有强烈的促进增殖和分化的刺激作用，在免疫细胞的信号网络中具有重要的调控作用。利用抗菌肽CM4能杀伤病原微生物和BAFF能促进B细胞增殖以及分泌抗体的功能，拟实现融合蛋白对病原体的双重抑制作用，因此本实验利用基因重组技术，将抗菌肽CM4和hsBAFF的融合基因定向插入原核表达载体pET28a和pET30a，构建了融合基因的两种原核表达载体pET28a／CM4．hsBAFF和pET30WCM4-hsBA

3、FF，并将两种原核表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中，通过实验摸索确定了两种融合蛋白表达的最佳温度和IPTG浓度，在宿主菌中获得高效表达，表达产物经Ni2+-IDA亲和层析和SephardexG．75凝胶过滤层析方法来纯化获得目的蛋白。经鉴定，融合蛋白具有抗菌活性和刺激B淋巴细胞增殖的生物学活性，该技术可以制备具有两种不同功能的活性蛋白。关键词：抗菌肽CM4；B淋巴细胞刺激因子；基因克隆；融合蛋白AbstractAntibacterialpeptideisakindofsmallsize

4、molecularpolypeptidethatisencodedbyaspecialgeneincell，stillisimportantmolecularprotectivescreenofthehostdefendpathogenicbacteriainvaders．Theproductionandreleaseofthiskindofpolypeptideistheingredientoftheinflammatoryreaction．TheantibacterialCM4hasbroadspec

5、trumofantibacterialeffectsonGram·negativebacteriumandGram-positivebacterium．Itkillsomevirus，fungusandprotozoon．Itcanalsokillsomecancerceilsselectively，butnotnormalcells．TheBlymphocytestimulator(BAFF)isanovelmemberofthetumornecrosisfactor口NF)ligandfamilywh

6、ichisimportantinBlymphocytematurationandsurvival．BAFFplaysacriticalroleinregulatingBcellimmuneresponses．ThefusionproteincaninhibitthemicroorganismstoutilizethefunctionsofABP—CM4CankillpathogenicmicroorganismsandBAFFCanpromoteBlymphocyteproliferationandsec

7、reteantibodies，SOthehumansolubleBlymphocytestimulatoractivingfactor(hsBAFF)genewasfusedtothesequenceencodingantibacterialpeptideCM4toconstructanexpressionvectorspET28a／CM4-hsBAFFandpET30a／CM4-hsBAFF．TherecombinantexpressionplasmidsweretransformedintoBL21(

8、DE3)PlysS，thenexpressedthefusionproteinintheoptimalconditionsandobtainedhighlyyield．TherecombinantproteinswerepurifiedbyNi2+．IDAandSephardex(}-75，andtestedtheantbacterialactivityandtheactivitytoBcellproliferationinv