13个稻瘟菌基因表达谱的分析及受稻瘟病诱导水稻转录因子osbtb基因生物学功能初探

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1、13个稻瘟菌基因的表达谱分析及受稻瘟菌诱导的水稻转录因子mB船基因的生物学功能初探摘要在前期工作中，对受稻瘟菌生理小种103(P06．6)侵染2、4、8h的抗性水稻品系c101A51(携带Pf2)叶片IⅢ{NA构建的cDNA文库进行EST测序，共获得了12，270条高质量的ESTs并产生5，74l条独立基因。应用BLAslm程序将这些序列分别与水稻和稻瘟菌基因组序列进行搜索(Bvalue≤一5)，结果有36TUTs与稻瘟菌基因组匹配，其中有13条独立基因仅与稻瘟菌基因组同源。利用本实验室保存的受稻瘟菌侵染的水稻叶片cDNA文库中2，171个独

2、立EST克隆制备完成的d，NA阵列，以稻瘟菌侵染8h的水稻近等基因系H7I{他7s的叶片总RNA为探针，通过芯片杂交、信号提取以及数据分析后，得到一批功能未知的基因。对未知基因通过生物信息学分析发现一个编码含有BTB结构域的蛋白的基因(克隆号为J001E09)并命名为伪四四。为了确证这13个推测的稻瘟菌基因的生物信息学结果和其在稻瘟菌致病性中可能的生物学功能：通过设计特异引物并测序获得了Os酎【B基因的全长cDNA。分别提取稻瘟菌生理小种Y34和粳稻秀水11基因组，运用Soud】锄blot杂交后，结果表明这13个基因确实来源干稻瘟菌，生物信息

3、学分析表明，除2个未知基因外，有2个分别编码环孢菌素(CyclophiliII)和P型A1P酶的基因(GeI】Ballk受理号B1808723和BQ907640)与稻瘟病菌侵染早期附着孢形成相关；c，4甲基固醇氧化酶和6一固醇C一甲基转移酶(B1813122和B0907428)参与稻瘟病菌致病性相关的膜蛋白——麦角固醇的台成；还有可能与稻瘟病菌侵染过程中信号传导相关的质膜钠离子应答蛋白(B1812033)；与蛋白合成相关的核糖体L12蛋白(BM㈣8)和延伸因子2∞Q907452)；与真核细胞细胞体内的蛋白质的运输和分泌相关的外被体蛋白(B18

4、13165)；参与脂肪酸生物合成的烯酰还原酶(BQ907177)等。一个编码丝氨酚苏氨酸蛋白激酶基因(BQ908235)参与了稻瘟菌孢子的产生：从受稻瘟病菌诱导水稻叶组织中筛选到的这些基因可能在病原与寄主的相互作用中起重要作用。No曲errlblot结果表明，这些基因在稻瘟菌的附着胞阶段都有不同程度的表达。除了环孢菌素基因在菌丝体阶段有表达外，其它基园在该阶段均未检测到。其中，质膜钠离子反应2基因∞1812033)和NebuJa相关蛋白∞M419917)仅在幼附着胞阶段表达；而参与麦角固醇的2个基因的表达模式相类似；丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶基因

5、在附着胞的发育过程中其表达呈递减趋势。这些结果不仅反映了它们可能的生物学功能，同时也从一个侧面反映了它们是高丰度基因。根据生物信息学获得的。啦四基因全长序列设计基因特异性引物，从水稻cDNA文库J001E09克隆中通过P睐扩增到基因的全长序列，测序确证了该基因的全长为1，975bp的cDNA序列，其中包含一个1，677bp的开放读码框。该基因编码一个含558个氨基酸的蛋白，并含有一个保守的BTB结构域a该序列与G廿lBank水稻基因组序列进行比对，获得长度为5，144bp的D撇序列，其转录起始点在上游30bp处，丑虹A框位于转录起始点上游一2

6、7bp处，CAAT框位于转录起始点上游约一llObp处。0_妒zB基因全长5，174bp，由6个外显子和5个内含子构成。对OsⅨ【B基因编码的蛋白进行生物信息学分析表明，该蛋白与核蛋白GMPQz的同源性为73．34％。利用珍汕97B，密阳46重组自交系群体明确。-据绉基因在染色体中的位置，发现该基因以单拷贝形式在水稻第二号染色体公共标记Rz324和ItM7l之问，遗传距离分别为0．4cM和4．2cM。将伤钟嚣的编码区ORF克隆进原核表达载体，纯化获得重组的osBTB融合蛋白。并以重组OsBTB蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得其多克隆抗体，wes

7、￡emblot结果证明该多克隆抗体能够与OsBTB蛋白结合，说明该蛋白编码正确。用、vest∞lblot检测不同水稻品系与不同稻瘟菌生理小种非亲和／亲和互作该蛋白的表达情况，结果表明，Os瑚[B蛋白在这些反应中的表达谱呈现多元化，不同水稻品种及其相应的稻瘟菌生理小种之间非亲和，亲和互作基因表达不同。用胶体金免疫标记法检测受稻瘟菌的水稻H7R叶片细胞，初步结果表明，OsBTB蛋自在水稻细胞中无亚细胞特异性定位。用定量盯_PCR方法检测了088TB基因以及9个功能已知的基因(如Pi一缸、P教葡萄糖苷酶基因、富含甘氨酸蛋白基因、几丁质酶基因、B一1

8、，3一葡聚糖酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因和遍在蛋白基因)在近等基因系H彻7s中连续5个时间段的表达情况，结果表明，魄B四基因与露缸、只6、几丁质酶基因和富含甘氨酸的蛋