胆固醇代谢qpcr+array检测方案的建立与其应用

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1、垡墨耋垡胆固醛岱谢韭￡＆蝴测左塞的建童丛甚廑周胆固醇代谢qPCRarray检测方案的建立及其应用摘要糖尿病患者往往存在血脂异常，是动脉粥样硬化的危险因素。血脂异常可以加速动脉粥样硬化的形成和进展，增加糖尿病大血管病变的发生与发展。然而机体内脂质代谢是一个相当复杂的生物过程，涉及到一系列的基因，糖尿病脂质代谢紊乱的发生机制尚不清楚。目前，研究基因表达差异的技术主要有表达谱芯片，I斟A测序，荧光定量PCR等。但是这三种方法都各有缺点：表达谱芯片中并没有准确的定量信息，结果需要大量的实验验证；表达谱芯片是一种广谱的筛选方法，其并没有针对性

2、研究基因，许多与研究对象无关的基因会产生大量无用或错误的信息，干扰结果分析；RNA．Seq能够检测样品中的所有RNA，而细胞中很大一部分RNA都来自核糖体和线粒体，限制了其他RNA的读取数量以及这些RNA表达水平的准确性。同时这两种方法，科研花费高，并且只能在专业实验中心完成。不具备在普通实验室完成的条件。定量PCR只能检测单个或几个基因的表达，无法大规模检测基因。因此，研究者需要一种便捷迅速、能够对某一特定生物学通路或疾病中相关基因进行针对性分析的定量工具，qPCRarray技术由此诞生。qPCRarray方案中最关键的步骤是引物

3、固化。引物固化后即可长期保存使用，为大规模样本的研究带来了便利。本实验通过将引物加鱼星!童望兰厘固醒垡进g￡￡壁塑望Y捡测友塞鲍建童拯墓廑旦热烘干，使其固定在PCR管底。并与未固定的引物作为对照组，在相同的条件下，进行荧光定量PCR反应。发现使用这两种不同方法处理引物时，相同样本中基因的表达量几乎一致。同时，本文还通过扩增效率、重复性以及特异性等方面对qPCRarray检测方案进行评估，发现qPCRarray具有以下特点：扩增效率高、使其可以采用相对定量分析，比较基因间的差异；重复性好，CT值的平均差异只有O．2个循环，可检测超过2

4、倍的基因表达量变化。因此，PCRarray是可以用来研究特定生物学通路或疾病中相关基因表达量的变化。本研究选择了88个胆固醇代谢基因和4个看家基因，同时设置了基因组污染质控以及阴性对照，建立了稳定可靠的qPCRarray检测方案。利用该方案检测高糖诱导下肝癌细胞中胆固醇代谢相关基因的表达水平。发现高糖能够影响胆固醇代谢相关基因(上调胆固醇合成基因、下调胆固醇逆转运)的表达，且部分基因呈现剂量及时间依赖性。综上所述，本研究建立了稳定可靠的qPCRarray检测方案。该技术是一种便捷快速、高通量、高灵敏度的功能基因组研究方法可以精确检测

5、高糖诱导下肝癌细胞中相关基因的表达差异。因此，qPCRarray技术可应用于个体水平的研究，并为研究多基因复杂疾病带来裨益。关键词：qPCRarray；胆固醇代谢；基因表达；葡萄糖；Hepal一6IIESTABLISHMENTANDAPPLICA．TIONoFCHoLESTERoLMETABOLISMqPCRARRAYABSTRACTDiabeticpatientstendtohavedyslipidemia，whichisariskfactorforatherosclerosis．Dyslipidemiacanaccelerate

6、atherosclerosis，atthesametimeincreasevascularlesions．However,thelipidmetabolismisacomplexbiologicalprocessthatinvolvesaseriesofgenes，thepathogenesisofdiabeticdyslipidemiaisunclear．Therehavebeenthreekindsoftechnologytostudythedifferentiallyexpressedgenesincluding：eDNAmi

7、croarray,RNA-seq，Real·T．imeQuantitativePCR．Thesetechniqueshavetheirowndisadvantages：eDNAmicroarrayisabroadspectrumscreeningmethod．So，manyoftheunrelatedgeneswillproducealotofuselessorerroneousinformation，interferetheanalysisSofresult．WhiletheabilityofRNASeqtOdetectallRN

8、Asinasample，itisadisadvantagewhentotalRNAisexaminedbecausesuchahigllproportionofcellularRNAarisesfromribosomalandmito