Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli

《Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、Journal of Biotechnology 156 (2011) 245–252Contents lists available at SciVerse ScienceDirectJournal of Biotechnologyjournal homepage: www.elsevier.com/locate/jbiotecOverexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variantCRM197 in Escherichia coliAlessandra Stefan a,b,

2、 Matteo Conti c, Diego Rubboli c, Lorenzo Ravagli a, Enrica Presta a,Alejandro Hochkoeppler a,b,∗abcDepartment of Industrial Chemistry, University of Bologna, Viale Risorgimento 4, 40136 Bologna, ItalyCSGI, Department of Chemistry, University of Florence, Via della Lastruccia 3, 50019 F

3、irenze, ItalyLaboratorio Farmaco-Tossicologico, Area Vasta Romagna, Cesena, Italya r t i c l ei n f oa b s t r a c tArticle history:Received 30 January 2011Received in revised form 20 June 2011Accepted 15 August 2011Available online 25 August 2011A.S., M.C., D.R. and A.H. dedicate this

4、 paperto the memory of Dr. Silvio Buzzi, whoalways enlightened with his suggestionsthe development of this project.Keywords:Cross-reacting material 197Synthetic geneOverexpressionEscherichia coliPurification1. IntroductionThe expression of the recombinant diphtheria toxin mutant CRM197 i

5、n bacteria other than Corynebac-terium diphtheriae has proven to be difficult. Here we propose a new and alternative procedure for theproduction of full-length CRM197 in Escherichia coli. The present study relates specifically to the expres-sion of an artificial sequence and to a method for

6、 the isolation and purification of the correspondingprotein. In particular, a synthetic gene coding for CRM197, bearing a short histidine tag and optimizedfor E. coli codon usage, was cloned in the pET9a vector. Accordingly, the over-expression of the pro-tein was simply induced with arab

7、inose in E. coli BL21AI. The recombinant protein was insoluble andalways found inside protein aggregates, which were solubilised using urea. Surprisingly, the expressionof CRM197, devoid of the short tag, always failed. Following a refolding step, the his-tagged CRM197was