实验二杀菌剂生物活性测定

《实验二杀菌剂生物活性测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、杀菌剂生物活性测定■生长速率法一、实验原理将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌牛长速度的快慢来判定药剂毒力的大小。病菌牛长速率可用两种方法表示：①一定时间内菌落直径的大小；②菌落达到一定直径所需的时间。二、实验目的通过木试验要基木掌握杀菌剂室内（离体）活性的牛物测定操作技术，掌握杀菌剂毒力回归曲线的制作及LCM的求解。三、实验材料I供试药剂：T•仲基托布津2.供试病原菌：苹果炭疽病菌3马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（”僅）配方：马铃薯2H;；葡萄糖却汁琼脂粉N-（或琼脂条吟）；自来水M

2、HiL；

3、K自然偏酸（X）制作方法：选择质量较好的马铃薯，削皮，去芽眼，切成薄片，称取加自来水煮沸后改小火煮5•■十（直至马铃薯片呈半透明状），然后用4层沾湿纱布过滤，滤液用水补足至MMiLo再加入琼脂用玻棒搅拌使其溶解（可适当加热）后加入葡萄糖搅匀，再补足水MMiL,最后分装于试管（用于接斜面）或三角瓶三角瓶盛约IWiL培养基），用无菌封口膜封好灭菌备用。采用湿热灭菌法，I2I°C下保持3«i*o4、实验器材：Ci的培养皿（T2个），PKl培养基，hl.移液管（・个），酒精灯，具塞刻度试管（■个），接种针（4个），超净工作台

4、（2台）。四、方法与步骤I•菌种准备实验室准备有菌源，在牛测前一个星期请自行转接。对菌种的要求：病原菌应容易培养，菌丝生长快速、整齐，产生泡子缓慢；菌丝最好在培养基平面上呈平伏放射状生长（有利于结果的测量）。在eZ的培养皿中，倒入约W-BiLPKL从培养皿或者斜面培养基上取一块病菌，放在培养皿中间，于2b°C下培养（AQ）备用。2.药液准备将供试药剂"仲基托布津用无菌水分别稀释成《H、4”、2M、・•、2fc#/L六个浓度的药液。SMif/L药液的配制：称取卜药剂，用无菌水溶解后,定容至VSSiLo称取药剂，用无菌水溶解并定容

5、至n-SbiLo3.打制菌饼在超净工作台上，用直径打孔器（预先醮F亿醇灼烧7次以灭菌）在培养好的供试菌种菌落外缘切下带菌培养基块■菌饼，这种来自菌落外缘的菌饼在新的培养基上生长速度的差异较小。2.带药培养基的制备采用混毒法制备带药培养基。将培养基于微波炉屮溶化（约需2-liA）o从低浓度到高浓度顺序处理。用hL移液管吸取hL药液放入刻度试管中，然后将热好的培养基（要冷却至8TC左右）倒入试管至・iL刻度，振荡混匀，立即倒入培养皿、放平，冷却后即成薄厚均匀的平板。所有浓度处理设三个重复。以舶勺吐温-W代替药液作对照。注意事项：①

6、配制药液及浇制带毒培养基的一切用具均应事先灭菌，操作最好在无菌室内进行，以防污染；②在设计药剂浓度时应考虑到药液和热培养基混合对药液的稀释及对培养基的稀释（如药液加入后将培养基稀释过多，则培养基不能凝固），一般以药液加入热培养基为宜，这样的比例不会影响培养基的凝固而药剂的真实浓度被稀释了I•倍；③对一些挥发性强的或易受热分解的药剂，应注意培养基的温度，最好冷至4WTC左右再将药液加入；④药液和培养基必须保证在凝固前充分混匀。热的带毒培养基倒入培养皿内应保持水平，否则将会造成皿内带毒培养基厚薄不匀，产生误差。«接菌饼用接种针或消

7、毒的银子将菌饼反向（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒的培养基上。每浓度药液处理重复7次（7个培养皿），每个培养皿最好是在中心放置I个菌饼。也可以在直径％I的培养皿中呈三角形放7个菌饼，但应注意病菌的生长速度及5个菌饼的间距和它们离皿壁的距离，否则得不到圆的菌落。b.检查结果及统计一般培养51即可检查，对于生长缓慢的菌种可适当延长培养时间。每个菌落用直尺以十字交叉法测量两个直径，每菌饼两个数据，可根据实际情况，取菌饼长短直径量取数据，取其平均值代表菌落大小。根据以下公式计算菌丝生长抑制率：XIH/菌落生长直径（■■）=两

8、次直径平均值一£•（菌饼直径）对照菌落生长直径■处理菌落生长直径菌丝生长抑制率三对照菌落生长直径药液浓度（“71）处理后审对照菌落直径（■■）处理菌落直径菌落生长抑制率（f）将供试药剂的离体活性测定结果记入表中，以浓度的对数值为横坐标，以生长抑制率的机率值为纵坐标，求出供试药液对供试病原菌菌丝生长的毒力回归方程、抑菌屮浓EC",并完成实验报告。