宏基因组学及其在口腔微生物探究领域中应用

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1、宏基因组学及其在口腔微生物探究领域中应用【摘要】宏基因组学研究特定生物环境中全部微小生物的基因组，直接从土壤和海水以及人体胃肠道和口腔等环境中获取样品DNA,利用适宜的载体将其克隆到替代宿主细胞中构建宏基因文库，以筛选新的活性物质和新的基因；因此，利用宏基因组学技术不仅能够有效地检测口腔微生物群落结构，同时还极大地扩展了口腔微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质和基因的机会。本文就宏基因组学的研究方法和宏基因组学口腔微生物研究领域中的应用等研究进展作一综述。【关键词】宏基因组学；微生物群落；遗传物质；口腔【中图分类号】Q781【文献标志码】

2、A宏基因组学认为，生命研究的对象应是生物环境中全部微小生物的基因组，即特定环境下所有生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌；因此，宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物群落研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。利用宏基因组学技术研究口腔微生物，无需单一分离培养某一种类的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微

3、生物，包括可培养和不可培养微生物。宏基因组学应用于口腔微生物的研究，主要包括两个方面：一方面进行微生物生态学研究，从整体微生物群落水平来研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多样性及其变化；另一方面是进行口腔微生物及其基因的研究，从中筛选到新的功能基因及其产物。通过这两方面的研究，较全面地了解口腔微生物的群落结构和功能基因组，为深入探索口腔微生物的代谢活动，最大限度地发掘口腔微生物资源提供可能。1宏基因组学的研究方法宏基因组学是从特定环境中直接分离所有微生物的DNA,选择合适的载体用于克隆DNA片段，将DNA片段克隆到宿主细胞中进行表达，根据某些生物活性

4、功能或基因序列筛选有价值的克隆并进行其功能分析。1.1宏基因组文库的构建1.1.1环境微生物DNA的提取环境样品DNA的提取是基因组文库构建中最重要的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，而且还要保证一定的DNA片段长度和完整性。根据提取样品总DNA前是否需要分离细胞，可将其提取方法分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可直接破碎样品中的微生物细胞而使其DNA得以释放。原位裂解法无需对样品微生物进行复苏，黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多样性。由于原位裂解法所提取的DNA片段仅为1〜50kb,故其通常

5、用于构建小片段插入文库（以质粒或入噬菌体为载体）的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来，然后以较温和的方法抽提其DNAo此法提取可以获得长度为20〜500kb的大片段DNA,而且纯度高，但却容易丢失微生物物种信息。该方法适用于构建大片段插入文库（以黏粒或细菌人工载体为载体）的DNA提取。1.1.2载体选择目的基因能否有效地转入宿主细胞并在其中高表达，在很大程度上取决于载体。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）等。质粒一般用于克隆小于10k

6、b的DNA片段，适用于单基因的克隆与表达。黏粒又称柯斯质粒或柯斯载体，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DNA片段的极限高达350kb,远远超过质粒载体的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对，转化率高，而且其以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。另外，构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道。1.1.3宿主选择目前，常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。一些缺陷型突变体细菌也可以作为宿主进行宏基因组文库的功能筛选。宿主的选择主要应考虑其转化率和宏基因表达以

7、及重组载体在宿主细胞中的稳定性和目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说，大肠埃希菌依然是最理想的克隆和表达宿主。也可以用其他宿主菌，例如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关基因的浅青紫链霉菌和一些革兰阴性细菌。也可以用穿梭黏粒或BAC载体将构建于大肠埃希菌的文库转入其他宿主，如链霉菌属或假单胞菌属中。根据不同微生物产生活性物质的差异和研究目标的不同，选择不同的宿主。随着技术的成熟和新宿主的选择，基因筛选率和功能基因检测率得以提高，进而宏基因组文库的目标基因的表达也得以提高。1.2宏基因组文库的筛选根据研究目的，宏基因组文库的筛选通常有功能筛选和

8、序列筛选两种方法。功能筛选最常用方法是根据重组克隆产生一些酶蛋白功能活性，采用各种检测手段，挑选活性克隆子，