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1、慢性根尖周炎感染根管中粪肠球菌PCR分析魏杰1孙宇21哈尔滨第四医院口腔科黑龙江哈尔滨1500262哈尔滨医科大学附属口腔医学院口腔修复科黑龙江哈尔滨150001【中图分类号】R781.33【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)16-0036-03【摘要】目的建立根尖周炎感染根管中粪肠球菌分布基线信息，探讨粪肠球菌与根管感染及再感染发牛的相关性。方法收集原发性根尖周炎感染根管(36例)及根管治疗失败再感染根管样木(47例)。提取DNA,粪肠球菌特异引物PCR扩增，比较分析两组样木中，粪肠球菌的检出率。结果粪肠球菌在原发
2、性感染根管和根管治疗失败再感染根管中的检出率分别为13.8%和53.2%,两组之间具有显著统计学差异(P&It;0.05)o结论粪肠球菌可能与根管治疗失败相关。【关键词】感染根管根管再感染粪肠球菌聚合酶链反应慢性根尖周炎是人类口腔常见病、多发病，细菌是导致根管感染的主要病因，随着牙髓病学治疗药物及治疗技术的不断发展，根管治疗的成功率已明显提高，但失败的病例仍有发牛。目前认为根管充填后残留在根管内的细菌仍然是造成根管治疗失败的主要原因，而粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)是再感染根管内最常检测到的细菌
3、。E.faecalis属于人体的正常菌群，也是人类机会感染的重要病原菌，常寄居于人类的肠道、阴道和口腔，在口腔的分布数量较少。未治疗根管的感染是多种细菌参与的混合感染，以革兰氏阴性绝对厌氧菌为主，同时还有一些兼性厌氧菌如链球菌、乳酸杆菌和放线菌［1,2］。而E.faecalis通常不存在或仅以很少数量存在于未治根管系统内，但在治疗失败后的根管中却常被检出，E.faecalis能在营养物质缺乏、高碱性、抗菌药存在的恶劣环境中生存，可能是到导致根管持续感染及治疗失败的主要病原菌，但目前此方面的研究在国内研究尚少。因此，本研究收集原发性根尖周炎
4、感染根管及治疗失败感染根管样本,采用PCR技术分析E.faecalis在不同感染状态下的检出率，初步讨论E.faecalis与根管感染之间的关系。1材料与方法1.1标本来源根据慢性根尖周炎诊断标准[3],自哈尔滨第四医院口腔科就诊患者中采集原发性根管再感染患牙根管样本39例，再感染患牙根管样本47例。排除标准：牙周袋探诊深度>；3mm；牙冠严重破坏致使髓腔直接与口腔交通着；隔湿效果欠佳者；有全身系统性疾病及过去六个月内使用抗生素、抗真菌药物者。1.2样本采集无菌高速手机裂钻，无菌水冷却下去除釉质、牙本质或残存充填材料后,棉卷隔湿，酒精
5、棉球消毒窝洞，低速球钻揭去髓室顶。15#K锂探通根管，到达大约根尖孔位置（根尖定位仪），消毒吸水纸尖插入根管中，吸取根管内液（干燥根管滴入少许生理盐水），纸尖在根管内停留1分钟后取出。连续采样三次，将三支纸尖立即置于同一个盛有lml硫乙醇酸盐传送培养液的消毒离心管中。冰浴转送实验室，・20°C冰箱保存备用。1.3DNA提取将临床采集的样本在室温解冻后利用细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒（鼎国，北京）进行样本DNA的提取。具体操作按试剂盒说明进行。E.faecalis引物[4]E.f-F:5’-GTTTATGCCGCATGGC
6、ATAAGAG-3’,E.f-R:5’・CCGTCAGGGGACGTTCAG・3’（上海中能博彩生物公司合成）。1.4PCR反应反应体系：10×PCR缓冲液5μL,Mg2+终浓度1.5〜2.0mM,10mMdNTP1μL,5U/μLExTaq酶0.2μL,25μmol/L引物各1μL,cDNA为模板2μL,去离子水加至50μL。具体反应条件如下：95°C预变性lOmin,95°C变性30s,60°C退火30s,72°C延伸30s,30个循环数，
7、最后一个循环72°C延伸10mino取PCR扩增液5μl,加入漠酚蓝2μl，点样于1.5%琼脂糖凝胶(5.0mg/l澳乙锭染色)，在TAE缓冲液中电泳45min,紫外与可见分析装置观察并记录。1.5统计学分析本实验选用卡方检验，利用SPSS10.0软件包对结果进行统计学分析。2结果采用E.faecalisa特异引物,以83例临床根管样本的DNA为模板,进行PCR检测。结果显示83例样本中，E.faecalisa的总体检出率为36.1%,其中在原发性感染根管和根管治疗失败再感染根管中的检出率分别为13・8%、53・2%,统计学上
8、具有显著差异(p&
9、t;0・05)3讨论根管治疗术作为最为有效的牙髓病、根尖周病的治疗方法，其目的是去除根管内的细菌、细菌分解产物及其代谢底物。但临床研究表明，即使是在完善的根管治疗术后，仍存
