兔纤维环间充质干细胞培养条件优化

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1、兔纤维环间充质干细胞培养条件优化中图分类号：R3文献标识码：A文章编号：1007-0745(2013)01-0126-01摘要：目的：选取合适的培养条件，促进兔纤维环间充质干细胞的增殖，维持其干细胞的特性。方法：从兔纤维环中提取间充质干细胞，进行体外培养扩增。考察丙酮酸钠对干细胞集落形成能力、增殖能力、细胞形貌和分化能力的影响。结果：丙酮酸钠明显增加兔间充质干细胞的集落形成的数目；促进细胞增殖；维持干细胞的干细胞特性；同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化。结论:丙酮酸钠可较好地促进体外干细胞增殖和

2、干细胞特性，使在体外快速获得大量良好状态的干细胞。关键词：干细胞培养丙酮酸钠细胞增殖细胞分化1.引言间充质干细胞具有多向分化特性，来源广泛，可从多种组织中提取。近期一系列研究表明，在正常及轻度退变椎间盘的纤维环中都存在具有多向分化特性的细胞，能在体外培养条件下被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，具有间充质干细胞的特征，但这些细胞的增殖能力有限l-3o本研究从兔纤维环组织中分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，通过改变细胞培养条件，考察其增殖能力和多向分化潜力，以期获取大量具有良好状态的干细胞。2•材料

3、与方法1.1药品与试剂5〜7月龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。DMEM-LG培养基、胎牛血清FBS、青-链霉素，购自Hyclone公司。胰酶，购自Gibco公司。成脂诱导培养基、成骨诱导培养基购自cyagen公司，茜素红、油红0购自Sigma-Aldrich公司。2.2兔纤维环间充质干细胞提取空气栓塞法处死新西兰大白兔后，在无菌状态下快速获取椎间盘组织并将纤维环组织分离出。将组织剪碎，以I型胶原酶消化、过滤。过滤后的细胞液体离心计数后接种于培养瓶中，分别加入2种培养基进行培养。其中一种培养基为含10%F

4、BS的DMEM-LG细胞培养液，另一种为含10%FBS和200ug/mL丙酮酸钠的DMEM-LG细胞培养液，于37°C、5%的C02培养箱中培养。每3天换1次液。2.3细胞增殖检测将细胞按1000细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别以无丙酮酸钠和含丙酮酸钠的DMEM-LG培养基连续9天检测细胞的增殖情况，每天6个复孔。进行MTT检测。2.4诱导分化检测将两种条件下培养的细胞分别按2X104细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板中，待细胞长到80-90%时，进行成脂分化和成骨分化。成脂诱导2周后进行油红染色。成骨诱导3周

5、后茜素红进行染色。1.结果3.1丙酮酸钠促进兔间充质干细胞集落形成细胞悬液按一定密度接种到100mm培养皿中后，到第3-4天即可观察到集落的产生，集落逐渐增大，到10天左右即可形成大量集落。对比有丙酮酸钠和没丙酮酸钠的培养基可发现，在相同接种密度的条件下，丙酮酸钠组形成的集落数更多，集落中的细胞数也更多。3.2丙酮酸钠促进兔间充质干细胞增殖MTT增殖检测发现，细胞从第1天开始增殖，第3天开始进入对数期，第6天以较为缓慢的速度继续增殖直至第9天。对比无丙酮酸钠组和丙酮酸钠组，相同条件下，丙酮酸钠组的细胞数明显更多。3

6、.3丙酮酸钠维持兔间充质干细胞的状态在细胞形貌上，无丙酮酸钠组细胞呈现异质性，有些呈梭形，有些呈纤维细胞状；而丙酮酸钠组的细胞则相对较为均匀，均呈现梭形。在传代次数上，无丙酮酸钠组的细胞只能传3-4代，细胞即停止增殖，由原来的梭形以及纤维细胞状转变为扁平无规状细胞。而丙酮酸钠组的细胞则至少可传代到6代以上，同时细胞也仍旧保持梭形的形貌。3.4丙酮酸钠抑制兔间充质干细胞的自发分化将无丙酮酸钠组细胞和非丙酮酸钠组细胞接种到24孔板中，分别进行成脂诱导和成骨诱导。在诱导组分别使用诱导培养基，对照组使用含10%FBS的DM

7、EM-LG培养基。但是在无丙酮酸钠组，对照组的细胞易自发成脂的现象。在培养1周后即自发产生脂滴，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大。油红染色后，亦有明显的染色现象。但是丙酮酸钠组的细胞则自发成脂的现象明显减轻。自发成骨的现象也更弱些。1.讨论本研究从兔子的纤维环组织中成功分离出一群具有克隆形成能力的细胞，该细胞较好地维持了原有形态。通过在DMEM-LG培养基中添加丙酮酸钠，发现丙酮酸钠可明显促进兔间充质干细胞的集落形成及增殖速度。此外，丙酮酸钠可维持干细胞的干细胞特性，维持较为均一的梭形形态，可传代6次以上。同时不影

8、响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化，在组织工程中将有良好的应用前景。参考文献：[ljFeng,G.etal.Multipotentialdifferentiationofhumananulusfibrosuscells：aninvitrostudy.JBoneJointSurgAm92,675-685(2010).[2]HenrikssonH,T