光谱法结合分子模拟表征脱氧土大黄苷和血清白蛋白分子作用机制

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1、光谱法结合分子模拟表征脱氧土大黄昔和血清白蛋白分子作用机制［摘要］目的：研究中药活性成分脱氧土大黄昔(desoxyrhaponticin,DES)与人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)的分子作用机制。方法：模拟生理条件下，计算机模拟技术结合荧光光谱法和紫外光谱研究药物与蛋白质的结合机制。结果：分子模拟建立DES与HSA的结合模型，表明维持药物与蛋白质的相互作用力主要是疏水作用力，兼有氢键作用。光谱实验表明DES与HSA的相互作用表现为动态结合过程，结合强度较强，DES与HSA分子的结合距离r值较小，说明发生了能量转移现象。DES对HSA的结构域微区构象产生影响，使结

2、合位域的疏水性发生改变。荧光相图技术解析出DES与HSA反应构象型态的变迁为'‘二态”模型。HSA与DES互作的热力学参数表明DES与HSA之间是以疏水作用为主的分子间作用。荧光偏振定量证明了HSA与DES相互作用过程中生成了非共价复合物。结论：光谱实验与计算机模拟结果一致，可为研究DES与HSA相互作用本质提供一定参考。［关键词］脱氧土大黄昔；人血清白蛋白；光谱实验；分子模拟血清白蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子等重要生理功能［1］。血清白蛋白相对分子质量较小，溶解性较大、稳定性较好、与配体具有较好的亲和性，易于分离、提纯且其三级结构已知，是理想的模型蛋白质分子。人血清白蛋白(h

3、umanserumalbumin,HSA)［2］为585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸全序列含有35个半胱氨酸残基，形成17对二硫键和一个自由的半胱氨酸残基，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是单个二硫键。HSA含有18个酪氨酸残基，在214位上含有一个色氨酸残基，N端为天冬氨酸残基，C端为亮氨酸残基。分析生理条件下药物与HSA的相互作用可以获得药物的药效学信息，深入阐明药物输送机制，也有助于为药物分析提供理论参考，此是具有意义的工作。脱氧土大黄昔(desoxyrhaponticin,DES),分子式为C21H2408,是天山大黄的有效成分之一，具有降血脂、降血糖、抗

4、肿瘤、调节机体免疫系统、抗血栓和抗氧化等作用［3］o当前，脱氧土大黄昔与人血清白蛋白的相互作用研究未见文献报道。本文基于光谱法结合分子模拟技术研究了DES结合HSA的相互作用，获得了结合反应常数、热力学函数等并考察了药物对蛋白质构象的影响，从分子水平上阐释DES与HSA的相互作用机制。1材料与方法1.1仪器与试剂人血清白蛋白(HSA,298%)、脱氧土大黄昔（DES,298%）、三密甲基氨基甲烷（Tris,GR）均购于上海华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为亚沸蒸馆去离子水。配制浓度为0.1mol•L-1,pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液（内含0.10mol・L-lN

5、aCl维持离子强度），用此缓冲溶液配制1.0X10-5mol-L-1的HSA,乙醇溶液配制1.0X10-3mol・LTDES溶液。F-4500型荧光光度计（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；ZD-2型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；SGI02计算机图形工作站，DOCK软件（4.02版本）。1.2分子模拟利用SGI02工作站上的DOCK4.02程序包建立药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。HSA晶体结构的PDB代码：lh9z。ChemDraw工具构建DES分子结构，然后基于分子力学MM2力场优化后生成实验分子模型，分子对接预处

6、理时使用AutoDockToolkit（ADT）进行受体与配体的优化处理。分子对接技术确认HSA活性部位，选择配体为中心的10范围为对接的活性中心。确定活性部位步骤：①确定DES结合活性位点；②在配体结合位点填充球簇以映射受体结合腔穴的性质；③尝试匹配不同小球中心的距离和配体中不同原子的距离，进行配体在受体活性位点处的构象搜索；④以经验势能函数作为评价函数，找到配体与受体的最佳结合方式［4］。程序的打分函数选择程序默认的输入和退火参数。针对建立的HSA-DES分子对接体系进行re-dock验证，去除DES后重新对接生成新的HSA-RWF(R-warfine)分子对接体系并比对PDB库数据

7、中原对接体系以确证可靠性。1.3方法HSA与DES溶液的荧光光谱及DES溶液的吸收光谱测定：移取2.5mLHSA溶液于1cm石英比色皿中，微量进样器逐次加入1.0X10-3mol-L-1DES溶液进行荧光滴定(滴定剂累加体积W100uL),缓冲溶液做荧光空白校正,荧光发射与激发狭缝宽度均为2.5nm,波长扫速1200nm•min-1,固定激发波长282nm,室温下绘制250〜900nm的发射谱；荧光光谱仪扫描激发波长和发射波长之间的