满天星异荭草苷对大鼠酒精性肝纤维化保护作用实验探究

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1、满天星异茲草昔对大鼠酒精性肝纤维化保护作用实验探究［摘要］目的：研究满天星异茲草昔对乙醇诱导形成的大鼠肝纤维化的干预作用及其机制。方法：90只雄性大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组（灌胃给予秋水仙碱1、0mg•kg-1•d-1）、异茲草昔低、中、高剂量组（灌胃给予异茲草昔25,50,100mg-kg-1•d-1）。实验过程中，模型组大鼠仅灌胃给予白酒，治疗组在给白酒的同时灌胃相应的药物，正常组则只灌胃等量的生理盐水。给药24周后，各组大鼠眼球取血、取肝脏，并测定血浆白细胞介素-6（IL-6）,人肿

2、瘤坏死因子-a（TNF-a）和血清谷丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、透明质酸（HA）,层粘连蛋白（LN）,HI型胶原（PCIII）和餐基脯氨酸（Hyp）的含量，检测肝组织髓过氧化物酶（MP0）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（S0D）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，Westernblot检测a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）和转化生长因子-Bl（TGF-B1）的表达，以及肝组织病理检查。结果：异茲草昔能够保护受损的肝组织，降低ALT,AST,IL-6,TNF-a,MDA,MPO,HA,

3、LN,PCIII和Hyp的含量（P血清中HA,LN,PCIII的含量采用放射免疫测定法（RIA）检测。肝组织中Hyp的含量测定严格按照试剂盒的说明书进行操作。2、6Westernblot检测肝组织中a-SMA表达水平用总蛋白提取试剂盒提取各组肝组织的总蛋白,Bradford法对蛋白样品进行定量。取出30ug蛋白样品至EP管中，加入4XSDS上样缓冲液至终浓度为1XSDS,95°C煮10min进行蛋白质变性，再进行100g•L-1的SDS-PAGE凝胶电泳,然后将蛋白质转至硝酸纤维膜上，用50g-L-1的脱脂牛奶于4°C封

4、闭过夜后，分别用a-SMA抗体(1：200),B-actin(1:1000)4£孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠TgG抗体(1：1万)室温2ho最后加ECL发光剂于暗室充分反应后用胶片曝光。将每个样本所测得的a-SMA蛋白灰度值，分别与对应的0-actin蛋白的灰度值相比，计算二者灰度比值。2、7肝组织中TGF-B1的检测分别取各组50mg肝组织，加1mL蛋白裂解液(裂解液组成：50mmol•L-1Tris,150mmol・L-1NaCl,5mmol・L-1EDTA,0、1%SDS,1%NP-40,1mg

5、•L-1Aprotinin,1mg•L-lLeupeptin,1mg•L-lPepstatin,2mmol-L-1PMSF),裂解30min,4°C,12000r•min-1离心10min,取上清，BCA法蛋白定量。加入上清缓冲液，100£加热5mino每孔上样20uL总蛋白，12%SDS-PAGE进行电泳，在转移缓冲液中，以100mA的电流转移到PVDF膜上。PVDF膜用含5%牛奶的TBST液封闭2h,加入大鼠抗TGF-B1单抗，4。（2孵育过夜。继以相匹配的辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2h,ECL试剂盒显色，B-

6、actin为内参，用图像处理系统进行分析。2、8统计分析实验数据以SPSS16、0统计软件进行统计学处理，以土s表示，用t检验进行组间比较，检验水准以P本实验采用乙醇灌胃的方法制备大鼠肝纤维化动物模型。实验结果表明，酒精性肝纤维化初期为不同程度的肝细胞脂肪变性。随着造模时间延长、乙醇摄入量的增多及动物体内多种有害因素协同作用，肝细胞出现脂代谢、糖代谢紊乱，细胞外基质（ECM）大量合成并在肝窦周围、胆管周围、汇管区、中央静脉周围等处沉积下来，形成肝纤维化。在酒精性肝纤维化形成过程中还同时伴随着肝功能标志物的改变及血清纤维化

7、标志物的变化［5］。上述病理变化与酒精性肝病的临床表现基本符合。长期饮酒会导致机体内促氧化物质明显增多、抗氧化物质减少，促生氧化应激，最终造成肝细胞坏死或凋亡［6］,激发肝组织的炎症反应，从而引起酒精性肝纤维化。肝细胞发生损伤时，肝细胞通透性增加，酶从肝细胞内外溢进入血液，使血液中ALT,AST浓度急剧升高。肝内胶原纤维的不断增加，也会促使肝纤维化的发生和发展，而胶原的沉积和降解受多种细胞因子调控，其中IL-6及TNF-a调控尤为重要［7-9］oIL-6及TNF-a在肝硬化的发生发展中参与肝脏的损伤-修复循环，引起大量E

8、CM的合成和沉积[10]o本实验中，满天星异茲草昔能显著降低肝纤维化大鼠中ALT,AST,HA,LN,PCIII,Hyp,MDA,IL-6,TNF-a及MPO的含量,提高SOD,GSH-Px的活性，表明了满天星异茲草昔能显著清除体内氧自由基，抑制促炎介质释放，降低胶原纤维的堆积,对脂质过氧化反应具有明显的抑制作用。肝