补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔mirna217的影响

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1、补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔miRNA217的影响楼丹飞，李越华，闫国良上海中医药大学附属市中医医院，上海，200071摘要：目的：观察补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔miRNA217的影响。方法：新西兰兔40只，随机分为对照组、模型组、补肾活血方组，立普妥组，除对照组外，高脂饲养16周，灌胃8周。检测血脂水平，HE染色观察胸主动脉形态，免疫组化观察端粒酶表达，Realtime-PCR检测miRNA-217基因表达水平。结果：与模型组相比，补肾活血方组和立普妥组血脂下降（P<0.05），端粒酶表达降低（P<0.01），miRNA-2

2、17表达降低（P<0.05）。其中，调节血脂效果以立普妥组为优（P<0.05），而补肾活血组miRNA-217水平低于立普妥组(P＜0.05)。结论：补肾活血方可能通过调控miR-217延缓内皮细胞衰老从而起到抗动脉粥样硬化作用。关键词：补肾活血方；miRNA217；动脉粥样硬化动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）多见于40岁以上的男性和绝经期后的女性，已成为全球的“第一杀手”，因此，动脉粥样硬化发生发展机制的研究对于预防和治疗心脑血管疾病尤为重要。AS与增龄、衰老密切相关，血管内皮细胞衰老在AS的发病中起着重要的作用，

3、而MicroRNA217可促进内皮细胞的衰老。本实验采用兔动脉粥样硬化模型，观察补肾活血方对动脉粥样硬化及miRNA217相关信号通路的影响。1材料与方法1.1实验动物：2月龄健康雄性新西兰大耳兔，体重2-3kg，共40只，均由上海斯莱克实验动物中心提供（许可证号：SCXK（沪）2012-0002）。适应性喂养1周。1.2实验药物：补肾活血方（熟地黄12g、女贞子12g、仙灵脾15g、川芎12g、水蛭6g、生山楂12g）由上海市中医医院制剂室制备；阿托伐他汀钙(立普妥，10mg/片，生产批号:D1420203390)购自美国辉瑞制药有限

4、公司。1.3造模及分组：40只新西兰大白兔随机分为4组:对照组予普通兔饲料,模型组、补肾活血方组、立普妥组予高脂饲料（5%猪油、1%胆固醇、94%基础饲料)。8周后从各组随机取出一只处死，与空白组对照,肉眼观察后三组主动脉内膜均有AS斑块形成,确认造模成功。继续高脂饲料喂养后三组，模型组每日给予等量生理盐水，补肾活血方组、立普妥组每日一次灌胃给药8周。1.4实验试剂：兔抗端粒酶抗体、山羊抗兔二抗、辣根酶标记链酶卵白素和DAB显色试剂，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；Trizol试剂：Invitrogenlifetechnologies

5、；上下游引物合成：上海皓嘉科技发展有限公司；DNAmarker、SYBR(R)PrimeScript™RT-PCRKit：TaKaRa；琼脂糖：上海生工生物工程有限公司。1.5标本取材：8周后麻醉后腹主动脉取血8ml，取胸主动脉、剥离血管外结缔组织，4℃生理盐水中冲洗3次，部分保存10%甲醛溶液，部分放入-70℃备用。1.6观察项目（1）采用日立7170型全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。（2）取胸主动脉进行石蜡包埋，HE染色，光学

6、显微镜下观察主动脉的形态。（3）采用免疫组化染色法结合图像分析方法，以累积光密度的均值作为衡量该组织端粒酶表达的指标。（4）实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测miRNA-217基因表达水平。用Trizol法提取细胞总RNA，紫外吸收测定法测定RNA的A260／A280比值，变性琼脂糖凝胶电泳法证实所提RNA的完整性。反转录后，绘制标准曲线，将所有cDNA样品分别进行目的基因和管家基因的RealtimePCR反应。采用相对定量——∆∆Ct法进行计算：待测组目的基因平均Ct值待测组看家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组看家基因

7、平均Ct值F=2—引物序列如下：内参β-actin：上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’；miR-217：5'-TACTGCATCAGGAACTGACTGGA-3'，反应条件：β-actin：95℃15s使RNA酶失活，30个循环（95℃5s62℃20s）扩增，62-95℃绘制溶解度曲线；miR-217：95℃15s使RNA酶失活，30个循环（95℃10s60℃20s72℃25s）扩增，60-95℃绘制溶解度曲线。1.7统计分析：以SPSS1

8、8.0软件进行数据分析，组间比较采用ANOVA(oneortwoway)或不配对t检验，P<0．05为差异有统计学意义。2结果2.1各组兔不同时间点血脂水平模型组TC、TG、LDL-C水平均高于对照组，HD