微生物染色技术

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1、染色技术山于微生物细胞含有大量水分(一般在80-90%以上),对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,与周围背景没有明显的明暗差。所以,除了观察活体微生物细胞的运动性和玄接计算菌数外,绝人多数情况下都必须经过染色后,才能在显微镜下进行观察。但是,任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微牛物标本是死的,在染色过程中微牛物的形态与结构均会发生-•些变化,不能完全代表其生活细胞的真实情况,染色观察时必须注意。木节包拾四部分:染色的基本原理二染料的种类和选择三.制片和染色的基本程序四、染色方法一、染色的基本原

2、理微生物染色的皋本原理,是借助物理因素和化学因索的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作川等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发牛地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料校易吸附,口吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就冇化学亲和力,易于吸附。但是,要使酸性物质染上酸性材料,必须把它们的物理形式加以改变(如改变pH值),才利丁吸附作川的发牛。相反,碱性物质(如细胞质)通常仅能染上酸性染料,若把它们变为适宜的物理形式,也同样

3、能与碱性染料发生吸附作用。细菌的等电点较低,凶值人约在2-5之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中,菌体蛋口质电离后带阴电荷;而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素,还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性,如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否,在染色上都起一定作用。此外,培养基的组成、菌令、染色液屮的电介质含量和pH、温度、药物的作用等,也都能影响细菌的染色。二、染料的种类和选择染料分为天然染料和人工

4、染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等,它们多从植物体中提収得到,其成分复杂,有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料,也称煤焦汕染料,多从煤焦汕中提収获得,是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类,难溶于水,而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水,通常制成盐类。染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质,分为酸性染料、碱性染料、中性(复介)染料和单纯染料四人类。1、酸性染料这类染料电离后染料离子带负电,如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等,可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类

5、分解产酸使pH值下降时,细菌所带的正电荷増加,这时选择酸性染料,易被染色。2、碱性染料这类染料电离后染料离子带正电,可与酸性物质结介成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结品紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染色。3、中性(复合)染料酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性(复介)染料,如瑞脱氏(Wright)染料和棊姆萨氏(Gimsa)染料等,后者常川于细胞核的染色。4、单纯染料这类染料的化学亲和力低,不能和被染的物质生成盐,其染色能力视其是否溶于被染物

6、而定,因为它们大多数都属丁•偶氮化合物,不溶于水,但溶丁•脂肪溶剂中,如紫丹类(Sudanb)的染料。〈返冋顶端〉三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多,各种方法应用的染料也不尽相同,但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。1、制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸镭水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成玄径约1厘米的薄层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层,若材

7、料为液体培养物或固体培养物屮洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可。2、白然干燥涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使Z干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒粘灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。3、固定标木干燥后即述行固定,固定的忖的有三个:1)杀死微生物,固定细胞结构。2)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉。3)改变染料対细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。固定常常利用高温,手执载玻片的--端(涂

8、有标木的远端),标木向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次,共约2-3秒钊并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60°C),放置待冷后,进行染色。以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍,但是应当指出,在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有:酒精(95%),酒精和醸各半的混合物,丙酮,1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常川。应川饿酸固定细胞的技术如下:在培养」】IL中放一玻璃,在玻璃上

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1、染色技术山于微生物细胞含有大量水分(一般在80-90%以上),对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,与周围背景没有明显的明暗差。所以,除了观察活体微生物细胞的运动性和玄接计算菌数外,绝人多数情况下都必须经过染色后,才能在显微镜下进行观察。但是,任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微牛物标本是死的,在染色过程中微牛物的形态与结构均会发生-•些变化,不能完全代表其生活细胞的真实情况,染色观察时必须注意。木节包拾四部分:染色的基本原理二染料的种类和选择三.制片和染色的基本程序四、染色方法一、染色的基本原

2、理微生物染色的皋本原理,是借助物理因素和化学因索的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作川等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发牛地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料校易吸附,口吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就冇化学亲和力,易于吸附。但是,要使酸性物质染上酸性材料,必须把它们的物理形式加以改变(如改变pH值),才利丁吸附作川的发牛。相反,碱性物质(如细胞质)通常仅能染上酸性染料,若把它们变为适宜的物理形式,也同样

3、能与碱性染料发生吸附作用。细菌的等电点较低,凶值人约在2-5之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中,菌体蛋口质电离后带阴电荷;而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素,还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性,如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否,在染色上都起一定作用。此外,培养基的组成、菌令、染色液屮的电介质含量和pH、温度、药物的作用等,也都能影响细菌的染色。二、染料的种类和选择染料分为天然染料和人工

4、染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等,它们多从植物体中提収得到,其成分复杂,有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料,也称煤焦汕染料,多从煤焦汕中提収获得,是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类,难溶于水,而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水,通常制成盐类。染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质,分为酸性染料、碱性染料、中性(复介)染料和单纯染料四人类。1、酸性染料这类染料电离后染料离子带负电,如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等,可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类

5、分解产酸使pH值下降时,细菌所带的正电荷増加,这时选择酸性染料,易被染色。2、碱性染料这类染料电离后染料离子带正电,可与酸性物质结介成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结品紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染色。3、中性(复合)染料酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性(复介)染料,如瑞脱氏(Wright)染料和棊姆萨氏(Gimsa)染料等,后者常川于细胞核的染色。4、单纯染料这类染料的化学亲和力低,不能和被染的物质生成盐,其染色能力视其是否溶于被染物

6、而定,因为它们大多数都属丁•偶氮化合物,不溶于水,但溶丁•脂肪溶剂中,如紫丹类(Sudanb)的染料。〈返冋顶端〉三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多,各种方法应用的染料也不尽相同,但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。1、制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸镭水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成玄径约1厘米的薄层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层,若材

7、料为液体培养物或固体培养物屮洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可。2、白然干燥涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使Z干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒粘灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。3、固定标木干燥后即述行固定,固定的忖的有三个:1)杀死微生物,固定细胞结构。2)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉。3)改变染料対细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。固定常常利用高温,手执载玻片的--端(涂

8、有标木的远端),标木向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次,共约2-3秒钊并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60°C),放置待冷后,进行染色。以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍,但是应当指出,在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有:酒精(95%),酒精和醸各半的混合物,丙酮,1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常川。应川饿酸固定细胞的技术如下:在培养」】IL中放一玻璃,在玻璃上

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