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1、烯丙孕素残留检测方法标准（试行）猪组织中烯丙孕素残留量的测定超高效液相色谱-串联质谱法（试行）1.范围本标准规定了猪组织中烯丙孕素残留量检测的制样和超高效液相色谱■串联质谱测定方法。本标准适用于猪肌肉、肝脏和脂肪组织中烯丙孕素残留量的检测。2.规范性引用文献下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成的协议的各方研究是否可使用这些文件的最新文本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于
2、本标准。GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法。3.原理试料中残留的烯丙孕素，用乙睛与乙酸乙酯混合溶液提取，超高效液相色谱分离，电喷雾串联质谱检测，外标法定量。4•试剂和材料以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的一级水。烯丙孕素对照品：含烯丙孕素（C21H26O2）不得少于9&0%甲醇色谱级乙膳质谱级乙酸乙酯色谱级甲酸质谱级超纯水rtlMilli-Q超纯水仪制取滤膜0.2pm烯丙孕素标准储备液
3、（1mg/mL）:准确称取含烯丙孕素5.0mg的对照品，于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，浓度为lmg/mLo-20°C贮藏，有效期6个月。烯丙孕素标准工作液（lyg/mL）：精确量取10pL烯丙孕素储备液于lOmL容量瓶中，用甲醇定容即可得到lpg/mL烯丙孕素标准工作液。・20。。贮藏，有效期6个月。5.仪器和设备液相色谱■串联质谱仪：配电喷雾离子源分析天平：感量O.OOOOlg,Precisa,ES225SM-DR天平：感量0.01g,Sartorius,BS2202S高速冷冻离心机：Hett
4、ich,MIKRO22R涡旋混合器：北方同正，HQ・60・II氮吹仪：OrganomationAssociates.Jnc,OA-SYSN-EVAP1126•试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。试料的制备包扌舌：——取均质后的供试样品，作为供试试料；——取均质后的空白样品，作为空白试料；——取均质后的空白样品，添加适量的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存・20°C以下保存。7•测定步骤7.1提取取肝脏/脂肪/肌肉匀浆样木2g±0.01g于10m
5、L离心管屮，加入5mL提取液(乙月青:乙酸乙酯3:2,v/v),涡动5min,离心lOmin(4°C,lOOOOg),取上清于新10mL离心管中,置于-20°C冰箱。7.2净化・20弋冷冻30min后，快速转移至预冷的离心机中,离心5min(4°C,lOOOOg),弃去脂肪层，快速转移溶液至新10mL离心管中，于氮吹仪40弋水浴下吹干，残余物用lmL20%的乙睹水溶液复溶，过0.2pm滤膜，进行UHPLC-MS/MS分析。7.3标准曲线的制备取7份空白样品，经提取净化后，添加适量的烯丙孕素标准工作液，
6、配制成7个不同浓度的基质匹配标准溶液，供超高效液相色谱■串联质谱测定。猪肌肉基质的七个浓度分别为0.5,1,2,5,10,20,50pg/kg；猪肝脏和脂肪基质的七个浓度分别为1,2,5,10,20,50,100Mg/kgo以测得的烯丙孕素特征离子峰面积作为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。求线性回归方程和相关系数。7.4测定7.4.1液相色谱条件超高效液相色谱仪：Agilent6495色谱柱：Phenomenex,Kinetex2.6gmC18100A50x2.1mm流动相：流动相A为0.1
7、%甲酸水溶液；流动相B为甲醇：乙睛(1:1)溶液流速：0.3mL/min柱温：30°C进样量:10pL梯度洗脱：梯度洗脱条件见表1。表1超尚效液相色谱梯度洗脱条件时间(min)流速(mL/min)流动相A(%)流动相B(%)曲线0.00.30505062.00.30208062.50.30010063.00.30505067.4.2质谱条件离子源：ESI/安捷伦喷射流离子聚焦(JetStream)毛细管电压：4000V喷嘴电压：0V干燥气流速(氮气)：llL/min干燥气温度:290°C雾化气(氮气)
8、：45psi鞘气温度：400°C鞘气流速：12L/min离子化模式：正离子模式(ESI+)扫描方式：多反应监测(MRM)Q1和Q3分辨率：单位分辨率0.7amu(Unit)离子驻留时间(Dwelltime):200ms烯丙孕素定性、定量离子对及对应的碎裂电压、碰撞能量见表2。表2烯丙孕素的定性、定暈离子对及碎裂电压、碰撞能暈化合物保留时间(min)离子对(m/z)碎裂电压(V)碰撞能量(eV)烯丙孕素1.90311.2>227.2*38024烯丙孕素1.
