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1、总黄酮的抗氧化性试验一、总黄酮的提取1、试验材料：2、试验试剂：蒸憾水、无水乙醇、芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、抗坏血酸（Vc）、磷酸缓冲液、PBS缓冲液、铁鼠化钾、2—硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯腓）所用试剂均为分析纯。3、试验仪器：试验的基本仪器（烧杯、移液管、量筒、试管、容量瓶、洗耳球、试管架、）、METTTOLEDO320酸度计、THZ—82B气浴恒温震荡器恒温水浴锅、可见分光光度计、循环水真空泵、离心机3、试验方法（1）芦丁（属于黄酮类物质，
2、乂名：芸香，维生素P）标准溶液的配制及标准曲线绘制将芦丁标准品烘干，用60%的乙醇溶液配置0.20%mg/ml的芦丁标准溶液，准确吸取芦丁标准溶液0.00ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml,分别置于7支25niL的比色管屮，加入5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀，放置6min;加入5%硝酸铝溶液1.0ml,摇匀，放置6min;加入4%氢氧化钠溶液10.0ml,用30%乙醇溶液定容，摇匀，放置12〜15min,备用。在510nm处测定吸光度（A）,以吸光度为纵坐标，芦丁标准品溶液的浓
3、度为横坐标，绘制标准曲线，得出芦丁含量C（mg/m1）与吸光度AZ间的回归方程。（2）测定样品屮黄酮含量（3）单因素试验黃酮提取率受很多因素的影响，为了分析影响因素A（乙醇浓度、提取吋间、提取温度、物料比）对提取率的影响，试验时让其它因索保持不变，而只让因索A改变，利用此单因素试验找出在其他条件固定时所考察因素的最佳水平，单因素试验是正交试验的基础。分别检查乙醇浓度、捉取温度、浸捉时间、料液比对总黄酮提取率的影响。（4）正交试验优化提取条件根据单因索实验结果，设计正交试验，选岀最佳提取条件。选定乙醇浓度⑷、料液比⑻、提取温度（C
4、）、浸提时间（D）4个因素,采用UC3）1正交表安排试验，因素与水平见下表：正交试验因素与水平水平乙醇浓度您）料液比（倍数）浸提温度（’C）浸捉时间（h）130204512502555237030653二、总黄酮的抗氧化性研究试验方法：黄酮提取液抗氧化性的研究采用Fe诱导卵磷脂脂质体过氧化一TBA法测定对脂质过氧化抑制率，清除疑基自由基测定采用反应比色法。1、黄酮类化合物还原能力的测定。在6根比色皿中各加入pH为6.6的磷酸盐缓冲液，再各加入样品液（具冇一定的梯度），用蒸懈水定容至一定刻度，加入1%的铁氧化钾溶液，混合物在50°
5、C恒温20min后快速冷却，再加入10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心lOmin,取上层清液加蒸憾水和的三氯乙酸溶液，在700nni处测定吸光度。2、总黄酮对轻自由棊（•0H）的清除试验在7根比色皿中依次加入一定量的FcS04溶液，lnmiol/LII2O2溶液，摇匀，加人水杨酸溶液，摇匀，放入37°C精密恒温水浴槽中加热15min后取岀，测It吸光度A。；A：黄酮提取物不同添加量清除疑自由基的方法，即加入一定量的提取物（具有一定的浓度梯度），用蒸憎水定容至10mL,摇匀，37°C水浴继续加热15min,取出测其吸
6、光度Ax。B：不同抗氧化剂清除疑口由基的方法，即分别用适量的三氯乙酸和提取物，蒸诸水定容至10mL,摇匀，37°C水浴继续加热15min,取出测其吸光度Ax。以柠檬酸对（・0H）清除率作对比分析。待测液对疑自由基（•0H）的清除率计算公式：（•011）清除率/%=（Ao-Ax）/AoXlOO3、总黄酮对超氧阴离子（0J•）的清除试验仏黄酮提取物不同添加量清除超氧阴离子的方法，即在室温下向比色管中加入pll二8的PBS缓冲液5.OmL,然后加入一定量的提取物（具有一定的浓度梯度）和（不加捉取物为空白对照），各加入适量的邻苯三酚，再
7、加入一定量缓冲溶液使体系总体积达到一定量，然后立即混匀，再以二次蒸馆水作参比，在322nni下测定吸光值A322（每隔30S测1次，直到反应启动后9min）,以吋间为横坐标，A值为纵坐标进行线形回归，得到直线斜率为反应速率V空和％。B：不同抗氧化剂清除超氧阴离了的方法，即在室温下向3根比色管中加入pll二8的PBS缓冲液，然后加入等量的柠檬酸溶液、Vc溶液、捉取物，各加入邻苯三酚,再加入一定量缓冲溶液使体系总体积达到一定量，然后立即混匀，再以二次蒸储水作参比，在322nni下测定吸光值A322(每隔30S测1次,直到反应启动后9
8、min),以时间为横坐标，A:i22值为纵坐标进行线性冋归，得到直线斜率为反应速率V空和V样。以Vc和柠檬酸对0J•的清除率作对比分析。超氧阴离子(0「•)的清除率计算公式：0；-清除率/%二(v%vQ/v空xioo4、DPPH(1,1-二苯慕-2-三硝棊苯脐)
