胶体金标记技术及其应用解析

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1、胶体金标记技术及其应用解析胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并市于静电作用形成一种稳定的胶体状态，故称之为胶体金。胶体金溶液的常见制备方法大致分为白磷还原法、硼氢化钠还原法、抗坏血酸盐还原法、柠檬酸三钠还原法和革柔酸柠檬酸三钠还原法。其基本原理是向一定浓度的金溶液内加入适量还原剂，使金离子还原为金原子。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例可得到所需不同直径的金颗粒。一.胶体金标记在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与目标蛋白质所带正电荷基团之间形成非共价键的静电吸引而牢固结合，这种结合对所标蛋白的生物学活性无明显影响。吸附在胶体金表而

2、的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒载运到组织或细胞内、固相载体上相应抗体或抗原的位置。由于金颗粒具高电子密度的特性，这些标记物在抗原抗体反应处聚集达到一定密度时(即金颗粒IO,个出现肉眼可见的粉红色斑点。胶体金试纸条胶体金试纸卡进行胶体金标记需耍对pl［环境、蛋白/抗体浓度、参数进行优化,采用的方法为浓度梯度法。A最适pH选择pH是标记过程的关键决定因素，一般在蛋白/抗体等电点pl略偏碱性的环境下标记效果最好，可以釆用加入0.1M碳酸钾或者0.1N盐酸的方法调节胶体金溶液的pll。同时，因为胶体金溶液可能损伤探头，所以常采用精密pH试纸进行pH测定。操作时将胶体金溶

3、液调节到3~10八个pH梯度，加入被标记的蛋白/抗体，混合后室温放置15min,再加入10%氯化钠室温放置15min,记录保持红色的最低pH,记为pHo；然后设置pH梯度为pH(rO.6、pHo-O.3、pH。、pHo+0.3、pHo+0.6、pHo+1,重复前面的操作,直到找到室温放置2h仍保持红色的最低pHo一般我们标记抗体IgG最适pH在9.0,单克隆抗体在8・2,SPA（proteinA）在5.9-6.2,其他常用的蛋白标记pH见下表：蛋白pH蛋白pH蛋白pH离子交换IgG7.6荆豆凝集素6.3牛血清白蛋白结合胰岛素5.3亲和层析抗体&2甘露聚糖7.0霍

4、乱毒素6.9F(ab)27.2过氧化物酶7.8~&2破伤风毒素6.9陛麻植物凝集素8.0类卵黏蛋白4.8RNA酶9.(T9.2花生凝集素6.3血浆铜蓝蛋白7.0DNA酶6.0HelixPromatiaLectin7.4脱唾液酸球蛋白6.0~6.5低密度脂蛋白5.5大豆凝集素6.1小牛血清白蛋H6.0~6.5a-巨球蛋白6.0LensPromatiaLectin6.9牛血清白蛋白5.2~5・5抗生物素蛋白10.0~10.6四边形莲花凝集素6.3牛血清白蛋白结合肽4.0~4.5链霉素抗生物素蛋II6.4~6.6B蛋白浓度优化优化了pH值后，继续优化标记的最低蛋白/抗

5、体浓度，也是采用梯度法，用不同浓度蛋白/抗体溶液与胶体金（已处于最佳pH环境）溶液混合后室温放置15min,加入10%氯化钠室温放置2h,测定OD52o^o,以吸光值对蛋白/抗体浓度作图，収线性趋势线与横轴交点的蛋白/抗体浓度为最小蛋白/抗体浓度。确定了最适pH及最小蛋白/抗体浓度后，可以开始进行金标记了。在调节好pH的胶体金溶液中边迅速搅拌边逐滴加入蛋白/抗体（浓度是之前确定的最小值的1.2倍），5min内加完，再加入10%BSA至BSA终浓度为1%,搅拌10min。低温超速离心去除未标记蛋白/抗体及未充分标记的胶体金，具体方法可参考：先1500rpm低速离心

6、1h去掉沉淀，然后15000rpm离心1h去掉上清，沉淀用含1%BSA的TBS溶解，重复高速离心三遍，得到可用于试纸条制备的金标蛋白/抗体溶液。C参数优化（部分条件优化举例）1样品垫与金标垫的组合优化样品垫处理液的pH设置三个梯度（7.2、&0、9.0）,金标蛋白/抗体溶液设置三个稀释倍数（1:1、1:2、1:3）制成金标垫，交叉组合观察加入阳性、阴性对照（生理盐水）后的显色情况（T线和C线均以1mg/mL的浓度包被）。显色情况判定阴性均不显色——阳性均显色+（视颜色深浅定义级別）这里主要是对样品垫处理液pH及金标物质的浓度进行优化，另外我们也可以对样品垫和金标

7、垫的处理液成分进行优化，这需要设计各种组合进行测试。样品垫吸收垫2T线、C线包被浓度优化将要包被的抗体进行1:1、1:2、1:3的稀释，包被NC膜后经阳性、阴性对照（生理盐水）检测观察显色情况，选择最佳稀释倍数（浓度）。将要包被的抗原进行1:10、1:20、1:40、1:50、1:100的稀释，抗体浓度采用上一步优化的浓度，包被NC膜，经阳性、阴性对照（生理盐水）检测观察显色情况，选择最佳稀释倍数（浓度）。当然，我们也可以采用组合试验进行二者包被浓度的优化’3检测垫封闭时间优化检测垫封闭时间设定lh、0.5h、lh、2h四个梯度，用之前优化的参数组装试纸条，加入

8、阳性、阴性对照（生理盐水