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1、多西环素含量及有关物质方法学验证方案扬州联博药业有限公司二00九年十二月实施人:审核人:批准人:目录1•验证概述12•验证用试剂及对照品13•验证□的14•验证范围15•验证项目及可接受标准16•实施验证的人员17•所用的仪器及设备18•验证内容29・验证结论131•验证概述根据EP6.0中对多西坏素含量及有关物质测定方法验证的要求，本实验室采用多西环索检测中用到的工作对照品盐酸多西环索替代多西环索进行方法学验证。在含量测定项下，分别就专属性、定量限、检测限、线性、冋收率和精密度进行方法学验证。另外，在本实验室研究该方法的耐受性试验，同时对该方法进行同人不同柱不同仪器和不同人同柱同仪
2、器条件下的相关实验。冇关物质方法学验证中，我们对多西环索中杂质美它环索，6-表多西环索的定量限，检测限，线性和加样冋收率进行验证。在耐用性试验中，通过适当改变检测条件，评价系统适用性的，对测定溶液的稳定性进行连续10h的跟踪测定。2.验证用对照品及试剂2.1对照品信息表1.验证屮使用对照品信息对照品名称批号生产厂家6■表多西环素美他环素盐酸多西环索2.2试剂信息表2.验证中使川试剂信息对照品名称批号主产厂家叔丁醇磷酸二氮钾硫酸氢化四丁基馁乙二胺四乙酸二钠3.验证口的：为了完善多西环素屮含量及有关物质测定方法的验证。4•验证范围：多西环素含量及有关物质的测定。5•实施验证的人员：康飞刚
3、，彭红彦6•所用的仪器及设备表3.验证屮所使用的仪器设备仪器自编号校验日期有效期HPLC/WatersZ0042009.12.272010.12.26HPLC/WatersZ0052009.12.272010.12.26电子天平Z0017.验证项目及可接受标准表4.验证项口及可接受标准验证项目可接受标准专属性分离度美他坏索和6■表多西环索RM1.256■表多西环素与多西坏素R22.0理论塔板美它环索N220006■表多西多西环NM2000多西多四环N2500检测限信噪比23多西环索定量限浓度3.0ug/ml美它环素浓度3.0ug/ml6-表多西环素浓度3.0ug/ml定量限信噪比$1
4、0多西环素定最限浓度3.0ug/ml美它环素浓度3.0ug/ml6-表多西环索浓度3.0ug/ml方法耐受性分离度美它环素与6-表多西环素RN1.256-表多西环素与多西环索R22.0线性含量RN0.9995有关物质R>0.999回收率含量95〜105.0%有关物质85〜115.0%精密度（6次含量测定误差）RSDW2.0溶液稳定性（10h内）RSDW2.0同人不同柱不同仪器、不同人同柱同仪器和同人同柱同仪器RSDW5.08•验证内容8.1测定仪器及检测条件8.1.1仪器：HPLC/water（一）自编号：Z004泵：Waters515检测器：2487紫外检测器工作站：N2000工作
5、站进样器：7725i手动进样器8.1.2测定条件柱（一）：P-LRP,250*4.6mm*8um,SerialNo.流速：1.Oml/min柱温：60°C检测波长：254nm流动相配制：0.2mol/L的KH2P04溶液：称取27.2gKH2P04加水1000ml溶解混匀。0.2mol/L的NaOIl溶液：称取&0gNaOil加水1000ml溶解混匀。pH二&0磷酸盐缓冲液:取50ml0.2mol/LKH2PO4溶液，加入46.80ml0.2mol/L的NaOH溶液，用水稀释到200ml混匀。流动相:称取60・0g叔丁醇于1000ml容量瓶中加约200ml水溶解,加400ml磷酸盐缓
6、冲液（pll=8.0）,50ml10g/L硫酸氢化四丁基钱溶液（用稀NaOII调pll二8.0）和10ml40g/L乙二胺四乙酸二钠溶液（用稀NaOH调pH二&0）,加水稀释至1000ml混匀,0.45um抽滤备用。8.2专属性试验8.2.1系统适用性试验精密称取美它环素对照品20mg、6-表多曲环素对照品20鳴、盐酸多西环素工作对照品20mg,分别到25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释到刻度并依次标示为1#，2#,3#。分别吸取1.0ml1#,1.5ml2#,4.0ml3#至同—25ml容量瓶中标示为4#,用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到刻度。在测定条件下进
7、样,分别进1#,2#,3#,4#四种溶液各一针，溶液4#的出峰顺序从而到后应为美它环素,6-表多曲环素，盐酸多曲环素。各个检出物的分离度与理论塔板见表5。表5.系统适用性结果表测定物质名称分离度R.理论塔板数N美它环素6■多西环表多西环表验证人：复核人:验证日期：复核日期：&3.定量限检测限测定取专属性项下溶液1#,2#,3#逐步稀释在信噪比大于10条件下测定定量限浓度，在信噪比大于3条件下测定检测限浓度。美它环素、6-表多西环素和盐酸多西环表的定量限与检
