基因工程复习材料01

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1、基因工程第一章绪论1、基因工程也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。2、基因工程优点打破了物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移3、理论依据1）不同基因具有相同的物质基础4）多肽与基因之间存在对应关系2）基因是可切割的5）遗传密码是通用的3）基因是可转移的6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代4、基因工程研究的基本操作程序a、目的基因的分离和制取d

2、、转基因植株的再生与检测b、表达载体的构建和目的基因与载体的拼接e、后代的遗传分析c、基因转移（导入）第二章基因工程工具酶限制性内切酶1、限制（restriction）:指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA,导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用：实际就是限制性内切酶降解外源DNA,维护宿主遗传稳定的保护机制。2、W（modification）：指寄主本身的DNA,由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用：宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。3、限制性核酸内切酶的概念是一类

3、能够识别双链DNA分子中的某种特定核昔酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。4、II型限制性核酸内切酶限制修饰：单功能识别序列：4-6bp回文序列蛋白结构：同源三聚体切割位点：识别序列内或附近特异切割辅助因子:Mg2+5、II限制性核酸内切酶的功能II限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段亍端为P,Y端为0H,识别序列一般为4〜6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180。的旋转对称性即迴文结构。II限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20p

4、L反应液中反应lh,使1pg标准DNA完全消化所需的酶量。6、II限制性核酸内切酶的主要用途①在特异位点上切割DNA,产生特异的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。7、II限制性核酸内切酶的星活性（staractivity）在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列，降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。星活性产生的原因如下：①反应体系中甘油的浓度大于5%。①酶用量过大，大于100U/微克DNA。②低离子强度，小于25mmol/L„酰胺等。离子的存

5、在。④DNA分子结构⑤核酸内切酶的缓冲液③高pH,大于8.0。④含有机剂，如乙醇、二甲基亚砚、二甲基乙⑤Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价8、影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度②DNA样品的甲基化程度③酶切反应的温度9、同裂酶与同尾酶同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核昔酸靶序列，这类酶称为同裂酶。Sma和Xmai(CCCGGG)。同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核昔酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端,这类酶称为同尾酶。阴加II(GGATCC))和加

6、II(AGATCT)。10、Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow酶。Klenow酶仍拥有5'->3'的DNA聚合酶活性和3'->5'的核酸外切酶活性，但失去了5'->3'的核酸外切酶活性。11、Klenow酶的基本用途：■I补平由核酸内切酶产生的歹粘性凹出末端IIcDNA第二链的合成■I抹平DNA的丁粘性凸出末端II双脱氧末端终止法测定DNA序列■IDNA片段的同位素末端标记12、T4DNA连接酶的作用机制DNA连接酶是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，已发现的DNA连接酶主要有两种：T4D

7、NA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4DNA连接酶的作用机制:①ATP+DNAligase(E)E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP转移到DNA的5，磷酸根上，使其活化，释放出酶。③活化的亍磷酸根与相邻的歹疑基形成丁，亍-磷酸二酯键，并释放出AMP。第三章基因工程载体载体(vector)是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面，而进行复制质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想质粒载