非放射性标记物brdu研究进展

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果非放射性标记物BrdU研究进展溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链　　DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有%[1]。既往在分子遗传学等研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速，然而其

2、敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术不断改良提高，应用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷相似[2，3]。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性标记物之一。本文综述近年来BrdU研究概况，重点介绍标记过程中有关技术问题。　　一、标记技术：　　1、剂量和途径：课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有

3、先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果　　BrdU可用于体内或体外标记，体内标记时，实验鼠按体重60mg-200mg/kg于鼠腹膜下注射[4，5]，狗按体重100mg/kg静脉注射[6]，人体以表面积150μg/m2用量，取标本前静脉注射[7]，免疫组化检测。BrdU经静脉给药一般无副作用，偶有报道过量可致细胞突变。体外标记的研究广泛而深入，通常将保存在培养液中的新鲜组织剪啐至1-2mm3大小，离心去除了上清液后，加入100μg/mlBrdU，或新鲜组织在/ml浓度的BrdU中37摄氏

4、度1小时，然后固定包埋[8]，细胞标记在RPMI1640-10培养液中进行，细胞数低于1×106/ml，加入20μl的BrdU孵育0[9]。　　2、标本处理：　　适当的标本处理对BrdU染色强度至关重要。Meyer对450例乳腺癌组织体外标记总结出3点经验：切组织块＜1mm厚；固定前组织有代谢活力；封闭脱氧胸腺核苷合成酶[2]，因此酶能使脱氧尿苷转变成脱氧胸苷，从而阻止内源性脱氧胸苷与BrdU竞争掺入DNA。Xiang最近回顾大量文献。广泛讨论固定包埋方法后，制备狗胫骨骨折模型，设3组对照研究，结果证明70

5、%乙醇固定，epon包埋未脱钙狗骨组织的BrdU染色效果最好[6]。Swales和Smith用BrdU单抗在超微水平研究昆虫血脑屏障，重点探讨标记过程对细胞超微结构特征的影响课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果。作者比较4种固定后得出如下结论：单用多聚甲醛固定可获得良好的标记效果，但细胞结构易损伤，可

6、加入单节显性戊二醛联合固定；等渗缓冲液加蔗糖磷酸/盐酸缓血酸胺缓冲剂或PBS对保持细胞结构有较好效果；用脱氧胆酸处理可增加标记，促进抗体联接，该项研究清晰显示线粒体，高尔基体、内质网等结果器[10]。也有人建议如准备蛋白酶消化时，可用甲醛固定，而不用Carnoy或乙醇。　　3、DNA变性　　BrdU掺入单链DNA碱基序列须经酸、碱、酶或加热等打开DNA双螺旋结构中的氢键，离子键和碱基推积力使DNA双链分离单链。DNA变性方式及程度直接影响标记效果，Williamson等回顾123份关于结直肠癌的报告，发现用

7、酸变性约占80%，作者在间设9个浓度比较分析，对每种浓度作用的组织切片分别数5×103个细胞，结果冰冻切片＜课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果hCL浓度变性后标记指数最高。低浓度酸产生高LI的原因可能DNA双链失稳态，组胺蛋白离解产生易使抗原掺入的SSSNA片段，另有人提出用低浓度酸从DNA离解出组

8、胺蛋白后加热变性，可避免组胺产生稳定DNA低抗热变性的作用。消除组胺可降低原位DNA的熔解温度阈，酸预处理使染色质核小体结构几乎全部破坏，从而使DNA解螺旋更广泛[11]。坚持热变性者认为加热较酸对BrdU掺入能提供更多结合部位。此外，变性和单抗孵育须严格衔接，如变性后BU20a单抗孵育延误1小时，BrdU阳性细胞核标记数便从%降至%[7]，说明影响LI的因素复杂，加单抗前仔细研究变性技术及干扰因素，从而获得Br