Brdu 细胞增殖检测实验

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1、Brdu检测细胞增殖实验实验操作:1．铺细胞，每个3.5cmdish10万个，在37℃、5%CO2孵箱中培养72h（细胞密度至50-60%左右）。2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu以铺满整个dish底面为准。)3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（P

2、H8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。8．加入1ml3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。12．加二抗（羊抗鼠IgG/AlexaFluor5941:100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60r/min）13．

3、将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细胞和蓝染的细胞核数目，然后进行统计分析。试剂配制：a.Brdu的溶解：室温下，将250mg粉末溶于2.5ml的DMSO中，储存浓度为100mg/ml分装，每管120ul，-20℃保存。b.2mol/LHCl：取8.333m

4、L12mol/LHCl的浓HCl，加入DDW定容至50mL。c.0.1mol/L硼酸钠：称量1.907g硼砂（Na2B4·10H2O381.36g/mol），加入DDW定容至50mL，调PH=8.3。d.0.2%TritonX-100：有0.5%的Triton-100（2.5mL原液溶解于47.5mL的PBS中），用PBS稀释至0.2%。e.3%BSA：称量1.5gBSA，溶解于50mL的PBS中。f.1%BSA：用PBS稀释3%BSA至1%。g.4%FPS：4%多聚甲醛。我是用DDW配制的，后来我发现很难溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度控制在60℃以下，也总是

5、担心多聚甲醛分解为甲醛，所以，我就总结为如下：提前配制。4%多聚甲醛溶液（pH7.2）试剂：多聚甲醛（PFA）4gDDW　至100ml配制方法：称取4g多聚甲醛（粉末状），置于三角烧瓶中，加入80mlDDW，放入37恒温水浴箱，每隔1-2小时摇晃混匀，16-24小时PFA会完全溶解。补充DDW，调节PH值。实验原理：1.免疫染色实验的基本原理利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性

6、的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。2.BrdU标记原理细胞增殖周期包括G1、S、G2、M4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期（S期）而同时又有

7、BrdU存在时,就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。BrdU抗体比较大，由于DNA双链结构的位阻，BrdU抗体无法直接与双链上的BrdU结合，必须先用使DNA部分变性，这样变性了的DNA单链上的BrdU才能与BrdU抗体结合，因此做BrdU细胞增殖实验一定要变性，当然变性的方法包括酸解，热解等，但是要注意变性的程度也很重要。建议采用EdU细胞增殖检测方法，无需变性，无需酶解，无需抗体，小分子染色，3小时完成实验。EdU是一种胸腺嘧啶

8、核苷类似物，能够在细胞增