种蛋白纯化的新思路,新方发法

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1、SSB亲和层析使用说明书一、简介噬菌体T7单链DNA结合蛋白（SSB,single-strandedDNAbindingprotein）由696bp核苷酸编码，计算分子量为25.6kDa（SDS-PAGE凝胶电泳，该蛋白条带约在27kDa位置）。它与单链DNA有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特性，将SSB构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有SSB标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA高效、特异性结合，这种结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的

2、pH值或盐浓度对融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。pSSB系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融合蛋白的N端或C端带有SSB标签。SSB标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切除，pSSB系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase）、凝血酶、TEV等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要决定是否切除标签。SSB亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化SSB融合蛋白及与目的蛋白有亲和

3、作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯度洗脱可得到高纯度的SSB融合蛋白。纯化条件温和，不引入其他物质，能够保证蛋白的活性。二、pSSB载体现有的pSSB载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类;2）酵母类;3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N端和C端的SSB标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB标签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示：表一：

4、pSSB系列载体宿主载体SSB位于目的蛋白的N端或C端抗性启动子蛋白酶切位点是否带His标签大肠杆菌E.colipSSB-E1N端卡纳抗性T7肠激酶否pSSB-E2N端卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-E3N端（SSB(△26C)标签）卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-E4N端卡纳抗性T7凝血酶是pSSB-E5N端卡纳抗性T7凝血酶否pSSB-E6C端卡纳抗性T7肠激酶是酵母YeastpSSB-Y1N端卡纳抗性nmt1肠激酶是pSSB-Y2N端氨苄抗性nmt1肠激酶是pSSB-Y3C端氨苄抗性nmt1肠

5、激酶是人细胞HumanpSSB-H1N端氨苄抗性CMVTEV是pSSB-H2C端氨苄抗性CMV肠激酶是昆虫细胞InsectpSSB-I1N端氨苄抗性PH肠激酶是pSSB-I2C端氨苄抗性PH肠激酶是具体信息详见网站：www.cellgenbiolabs.com。一、插入基因片段每一个pSSB表达载体设计有多个克隆位点。根据需要，DNA片段可被插入到某一特定的位点。二、优化表达插入DNA片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带SSB标签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长

6、条件后就可以进行大规模的培养。生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使用正确的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包涵体状态或可溶状态。SSB在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能力，如：生长温度降低至15-30℃，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白

7、表达的速率等。一、ssDNA-cellulosessDNA-cellulose由单链DNA（ssDNA）与处理过的cellulose进行偶联所得，大约1gcellulose可以偶联2-3mg的ssDNA。ssDNA可以与SSB特异性结合，且1ml溶胀好的ssDNA-cellulose柱料可以结合1-2mg的带有SSB标签的融合蛋白。此介质是自主设计合成的，具有优良的物理和化学稳定性，操作方便，批次重复性好，是研发的理想选择，具体性能参数如表二所示：表二：ssDNA-cellulose的性能参数特

8、点成本低，操作方便基质纤维素吸附载量1ml吸附1-2mg的SSB融合蛋白介质平均直径100μmpH范围3-10保存温度4-8℃保存条件干燥保存二、纯化SSB标签蛋白可以通过亲和层析柱（ssDNA-cellulose）比较方便的从细胞裂解物中纯化。纯化时，标签蛋白与配体结合，杂质通过结合缓冲液被洗脱去除，之后标签蛋白在温和、非变性的条件下被洗脱下来，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保护。如果需要将SSB标签从目的蛋白上切除，标签蛋白可以在与ssDNA-cellulose结合时使用合适的位点特异性蛋白