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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划荧光素酶报告实验步骤 荧光素酶活性实验 .以5*10的细胞/孔接种于24孔板中，24hr后用磷酸钙转染，转染所有所需的DNA。包括受体表达载体、包含荧光素酶报告基因的各种表达质粒和B-gal半乳糖苷酶表达质粒共转入细胞中。 (2).弃去培养液后，PBS洗一次，每孔加入120ul裂解液，4℃放置10min，13000rpm离心5min，取上清。 .B-gal半乳糖苷酶活性测定： 配制B-gal半乳糖苷酶活性测定液：880ulONPG+40ul100*镁离子溶液+22
2、80ul磷酸盐缓冲液。每个样品加入B-gal测定液120ul和细胞裂解液20ul。 以上混合液于37℃孵育至有黄色出现为止，加入60ul1M的Na2CO3终止反应。于酶标仪410nm测定吸收值，以此作为B-gal半乳糖苷酶的相对活性，用于内对照，已标定转染效率。 .荧光素酶活性测定： 将20ul的细胞裂解液与10ul的荧光素酶检验试剂混匀，立即用sepctrafluorplus检测发出的荧光信号，该荧光值与相对应的B-gal半乳糖苷酶的OD值之比为标定后的荧光素酶的相对活性。附:试剂配方：目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专
3、业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 磷酸盐缓冲液：NaHPO4，Na2HPO4详细配法见分子克隆 100*镁离子溶液(MgCL2,5MB-巯基乙醇) ONPG4mg(O–nitropheny-B-D-galactopyanoside)溶于1ml磷酸盐缓冲液 Lueiferinsolution:10mgLueiferin溶于36ml5MmKH2PO4(),分装成432ul每管.储存于-80℃.用前应先于室温放30min,注意避光。 ATP:25ml1MTris+5
4、ml1MMgCL2+分装成120ul每管.储存于-80℃. PBS溶液，以1L量为例： NaCl80g9 Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O 加双蒸水900mL左右，用HCl/NaOH调pH至，最后定容为1000mL。4 双荧光素酶报告系统目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在
5、用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系
6、统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测,通常一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,比如,培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。目的-通过该培
7、训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势,比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行,但CA
