分子生物学实验报告.陈倩倩

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1、质粒DNA的提取，纯化及验证陈倩倩学号：118627140313一，实验目的：1，掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。二，实验原理：碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共

2、价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。

3、质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。三，实验仪器试剂和材料：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管等菌体：E.coliDH5α受体菌试剂：LB培养基，氨苄青霉素，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液。四，实验步骤及现象①准备灭菌㈠LB培养基20ml/100ml，50ml/300ml，㈡枪尖

4、：1000μl,200μl,20μl㈢离心管1.5ml/500ml,50ml×2㈣吸管：10ml②质粒的提取。步骤备注1，E.coliDH5×﹙Puc19﹚在20ml培养基中培养过夜，转接到50ml培养基37度培养四到五小时，7000rpm离心五分钟，称量空管重量。1，溶液装入离心管时，要使液面离管顶至少1cm2，在接菌时，将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中空管质量为13.

5、877g2，弃上清，加5ml溶液Ι，打散菌泥洗涤，再离心干燥，称重。加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。称重后其菌泥质量不足200mg，按200mg计算3，每100mg菌泥加溶液Ι1ml打散混匀，冰溶5min1，避免破壁后的的染色体断裂，并且此时出现粘稠透明的胶状物2，冰浴的目的即为降低酶的活性，防止酶将质粒DNA降解。4，按量加入溶液Ⅱ2ml，轻加轻摇混匀。溶液Ⅱ为强碱性溶液，目的是使细胞破裂，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA

6、的大部分氢键断裂。在加溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，此时，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状。5，按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴十分钟。溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。6,12000rpm离心15min，上清液轻轻转入新管，再加入十分之一3mol/lNaAc，混匀。由于DNA带负电荷，加入NaAc的作用就是是中和

7、DNA所带的负电荷，使DNA之间的排斥力减小，有助于DNA的沉淀7，加入两倍体积冰无水乙醇，混匀。零下20度沉淀无水乙醇的作用是沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂8,12000rpm离心15min，弃上清加入3ml70%乙醇，不打散沉淀洗涤一遍70％乙醇的作用一方面是继续沉淀DNA，另一方面可以除去上一步骤中溶解在溶液中的盐离子9,12000rpm离心5min﹙注意沉淀位置﹚弃上清，干燥，加入1mlTE溶解。用

8、记号笔在沉淀周围做好记号①质粒纯化加入RNaseA使其终浓度为50微克每毫升，37度0.5至1h，平分为两个小管。RNA酶分解掉RNA1，加等体积的Tris饱和苯酚溶液混匀7000rmp离心15min，上清液转入新管。苯酚具有强氧化性，在此步骤中是使蛋白质变性，从而使蛋白质沉淀下来2，加等体积的苯酚：氯仿（1:1）混