《本科实验理论》word版

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1、细胞破碎常用方法方法技术原理效果成本机械法研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜组织捣碎法细胞被捣碎机捣碎适中适中匀浆法须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵酶法外加酶或自溶法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵化学法有机溶剂法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜表面活性剂法表面活性剂溶解细胞壁温和适中物理法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜反复冻融法15℃至-20℃冷冻，再室温下融化，膜的疏水键被破碎温和撞击破碎干燥法体细胞失水剧烈温度差破碎法思考题1常用的细

2、胞破碎的方法有哪些？2有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些答:笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等3酶法破碎细胞原理答:酶分解作用4反复冻融法破碎细胞原理答:通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用层析技术方法简介层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。分类（1）分配层

3、析（2）离子交换层析（3）凝胶过滤层析（4）亲和层析（5）吸附层析一、离子交换层析㈠基本流程上样：洗脱：pH梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱检测、记录分部收集。㈡离子交换分离基本原理不同氨基酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等电点不同，在同pH条件下带电性能不同，与交换剂结合力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后被洗脱出来，从而被分开。阳离子交换剂交换原理：RC-C1++C2+RC-C2++C1+㈢离子交换层析过程中的关键技术1、交换剂处理①漂洗目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒（这一步一定要到做位。

4、留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。）直至水清澈无色。②处理用酸碱轮换浸泡，以便使交换剂带上需要的平衡离子。③平衡经处理后，要用大量的水悬浮交换剂，最后用缓冲液平衡2、柱的选择与装柱装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝。3、上样要求加入样品液的体积一般应小于床体积的1/3。4、洗脱剂原则四条：①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平

5、衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。5、洗脱速度洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。二、凝胶过滤层析1、原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。2、常用凝胶：(1)天然凝胶：琼脂糖凝胶(2)人工合成凝胶:葡聚糖凝胶（其商品名称Sephadex），有G-25，G-75，G-100，G-200等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即

6、每g干胶吸水毫升再乘以10.不同规格的凝胶性质不同，常用G-25脱盐。3、应用：(1)分离、纯化与鉴定；(2)测定相对分子质量；三亲和层析1、原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。2、应用：酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。四吸附层析1、原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。2、分类：(1)物理吸附，如：活性炭；(2)化学吸附，如：氧化铝；(3)交换吸附，如：硅胶。思考题：1.什么叫层析

7、技术？常用的层析技术有哪些？2.指出常用层析技术的应用范围。答:凝胶层析法⑴脱盐⑵用于分离提纯⑶测定高分子物质的分子量⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子高效液相层析法⑴液-固吸附层析⑵液-液分配层析⑶离子交换层析3．SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？答:大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用4.用SephadexG25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在Sep

8、hadexG-75柱中分开？为什么？答:不能,分子量差距太小6.将分子量分别为a（90000）、b（45000）、c（110000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。答:c、a、b7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？8.离子交换层析的原理？答:根据自交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小的差异进行分离9.如果样品中只有Ala和His(AlapI