db33-t 454—2003 动物血清中盐酸克伦特罗残留的检测方法

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1、DB33/T××××—2003浙江省质量技术监督局发布2003-11-08实施2003-10-23发布动物血清中盐酸克伦特罗残留的检测方法TheanalysisofclenbuterolhydrochlorideinanimalserumDB33/T454—2003DB33浙江省地方标准ICS71.040G04备案号：14769-20041DB33/T454—2003前言本标准由嘉兴市卫生监督所提出并归口。本标准由嘉兴市卫生监督所、浙江省畜产品质量安全检测中心、嘉兴市疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心负

2、责起草。本标准主要起草人：吴小龙、沈志英、邹忠明、宣士荣、吴平谷、葛志坚、王明龙、汪刚。IDB33/T454—2003动物血清中盐酸克伦特罗残留的检测方法1　范围本标准规定了以酶联免疫吸附（ELISA）法和气相色谱-质谱联用（GC/MS）法测定动物血清中盐酸克伦特罗的方法，规定气相色谱-质谱联用法为仲裁法。本方法适用于动物血清中盐酸克伦特罗残留量的测定与仲裁。2　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标

3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。DB33/T307-2001可食性动物组织中盐酸克伦特罗残留量的检测方法DB33/T308-2001饲料中盐酸克伦特罗含量的检测方法DB33/T309-2001动物尿液中盐酸克伦特罗残留量的检测方法3　酶联免疫吸附法3.1　原理利用固相酶联免疫吸附原理，将盐酸克伦特罗特异性抗体(羊抗兔IgG)包被于聚苯乙烯微量反应板中，加入血清、盐酸克伦特罗标准品、酶标记物、盐酸克伦特罗抗体于微孔中，使血清

4、（未知抗原）和酶标记物中的盐酸克伦特罗抗原（已知抗原）与抗体进行免疫竞争反应，未反应的酶标记物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶标法来判断。显色的强弱与样品中的盐酸克伦特罗浓度成反比。3.2　试剂和材料以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为重蒸水。3.2.1　盐酸克伦特罗固相酶联免疫试剂盒（德国r-Biopharm公司或类似产品）。3.2.1.1　预包被微孔条。3.2.1.2　标准品（6瓶×300μL/瓶，浓度分别为0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、

5、2700ppt、8100ppt）。3.2.1.3　盐酸克伦特罗酶标记物。3.2.1.4　盐酸克伦特罗抗体。3.2.1.5　基质液。3.2.1.6　终止液。3.2.1.7　缓冲液。3.2.2　50%乙醇。3.3　设备与器材3.3.1　酶标仪。3.3.2　洗板机。3.3.3　离心机（3000r/min-4000r/min）。3.3.4　超声清洗仪。3.3.5　振荡器。3DB33/T454—20031.1.1　水浴锅。1.2　样品处理1.2.1　取1mL血清加入50%乙醇1mL混合，超声清洗仪处理30min。1.2

6、.2　以不少于3000r/min离心10min，取其上清液，氮气吹干或100℃水浴锅挥干。1.2.3　在残留物中加入水1mL，超声清洗仪处理10min；不少于3000r/min离心10min，取其上清液待测。1.3　测定（或参考类似产品说明书）将试剂盒各组分取出，平衡至室温(20℃-25℃)。1.3.1　以1：11的比例吸取盐酸克伦特罗抗体加入到缓冲液中，待用。1.3.2　以1：11的比例吸取盐酸克伦特罗酶标记物加入到缓冲液中，待用。1.3.3　每孔加入已稀释盐酸克伦特罗抗体100μL，15min后洗板。1.

7、3.4　分别加入标准品、待测样品(标准品和样品做两孔平行试验)各20μL。1.3.5　每孔加入已稀释盐酸克伦特罗酶标记物100μL，30min后洗板。1.3.6　加入100μL基质液避光显色15min，加入终止液100μL。1.3.7　酶标仪450nm测定。1.4　结果计算1.4.1　计算每个标准品和样品平均吸光度值。1.4.2　每个标准品和样品平均吸光度值除以0ppt的吸光度值再乘以100。以标准品的百分比形式的吸光度值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘成一个半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的相对浓

8、度（μg/L）可以以样品平均吸光度值从曲线上查出，乘以样品稀释倍数，即为其实际浓度。1.5　检测限本方法的检测限:0.2μg/L。2　气相色谱-质谱联用法（仲裁法）2.1　原理血清用乙酸乙酯提取；提取液浓缩后经SLH柱净化，净化洗脱液经过双三甲基甲硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（φ）三甲基氯硅烷（TMCS）衍生，然后用GC/MS法测定。2.2　试剂和材料以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析