寄生虫病原检查技术

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1、第五篇实验技术及抗寄生虫药物第十七章寄生虫病原检查技术寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介绍第一节粪便检查粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查，或暂时保存在35°C～37°C条件下待查。盛粪便的容器须洁净、干燥，并防止污染；粪便不可混入尿液及其它体液等，以免影响检查结果。具体方法如下：（一）直接涂片法（directsmearmethod）用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法

2、简便，连续作3次涂片，可以提高检出率。1．蠕虫卵检查25滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上，用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有的色泽；卵内含卵细胞或幼虫。2．原虫检查(1)活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。（2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水，粪便涂抹方法同上。若同时需检

3、查活滋养体，可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本，再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊；另一侧查活滋养体。碘液配方：碘化钾4g，碘2g，蒸馏水100ml。（3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存（4℃1个月内）的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下：金胺－酚（auramine-phenol）染色法：1)染液配制：1g/l金胺—酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石25炭酸5.0g，蒸馏水10

4、0ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95%酒精100ml；5g/l高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，呈环状，核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。改良抗酸（modifiedacid-fastmethod）染色法：1)染色液

5、配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95%酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中）；20g/l孔雀绿液（第三液）：20g/l孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5～10分钟后水洗；滴加第二液，1～10分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。25经染色后，卵囊呈玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。如染色（1.5分钟）和脱色（2分钟）时间短，卵囊内子孢子边界不明显；如染色时间长（5～10分钟）脱色时

6、间需相应延长，子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。不具备荧光镜的实验室，亦可用本方法先染色，然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好，可提高检出速度和准确性。金胺－酚染色－改良抗酸复染法用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察，卵囊同抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成兰黑色，两者颜色截然不同，极易鉴别，使检出率和准确性大大提高。（二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modifiedKato’sthick

7、smear）厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约50mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油—孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和1ml3%孔雀绿水溶液）中至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。25使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间，如粪膜厚透明时间短，虫卵难以发现；如透明时间过长则虫卵变形，也不易辨认。如，检查钩虫卵时，透明时间宜在3

8、0分钟以内。(三)浓聚法（concentration