2017-2018学年高中生物第六章蛋白质和dna技术6.2dna片段的扩增___pcr技术1素材中图版选修1

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1、对高中生物课本中PCR技术的几点思考一、为何不需要解旋酶？DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，由ATP提供能量,在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC—95oC，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶。二、为什么加入的原料是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）,而不是四种脱氧核苷酸？同学们在学习DNA复制的时候，都掌握了DNA的复制需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，

2、而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）。同学们都有这样的疑问：同样是DNA的复制二者所需要的原料为何会不同呢？事实上在DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），在DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3’，5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。（摘于沈同、一镜岩主编的第二版《生物化学》下册P328）。而在生物体

3、内脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核苷酸二磷酸、脱氧核苷酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。三、为什么没有加入ATP？DNA的体内复制需要ATP作为能量物质，而体外利用PCR扩增目的基因为何没加入ATP呢？因为体内DNA的复制过程中，解旋酶将DNA双链解成单链、脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成需要ATP提供能量。而体外DNA的扩增不需要解旋酶的催化，是通过提高温度使双链解成单链，这一步不需要ATP提供能量；由问题二可知形成磷酸二酯键所

4、需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解（在体内是脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受ATP提供的磷酸基转化为脱氧核苷酸三磷酸时，将ATP内高能磷酸键的能量转移到脱氧核苷酸三磷酸分子内）。所以体外PCR扩增目的基因不需加入ATP。四、延伸过程是否需要DNA连接酶？现行的一些相应配套习题关于PCR扩增目的基因是否需要DNA连接酶说法不一，本人查阅到体内DNA的复制是边解旋边复制，且是半不连续复制，DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5’－3’，另一条链为3’—5’，而DNA聚合酶的合成方向都是5’—3’，所以在3’—5’走向

5、的模板链上能以5’—3’方向连续合成，称为前导链，另一条5’—3’走向的模板链上随复制叉的移动，形成许多5’—3’方向的不连续片段（称为冈崎片段），在DNA连接酶的作用下连接成一条完整的DNA链，称为滞后链。PCR扩增的原理是DNA双链复制的原理，但过程却不同于体内复制过程，既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制，是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶作用下同时以5’—3’方向连续合成进行延伸，不存在前导链与滞后链的区别，自然也就不需要DNA连接酶了。五、引物的作用是什么？在学习过程中学生问到这样

6、的问题：必修课本DNA复制那一节并未介绍DNA的复制需要引物，而利用PCR扩增目的基因的时候则需要引物，那加入引物有何作用呢？实际上DNA的复制都需要引物，在体内复制时，先由RNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA3’端开始合成新的DNA链，高中阶段为便于学生理解DNA的复制就没有介绍这部分知识，体外复制当然也要加引物了。但PCR技术扩增目的基因进加入引物还有特殊的作用。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产

7、物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎

8、可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用（见下图示）。由以上分析可知引物决定了扩增基因的特异性。引物1新引物物5’5’5’5’3’3’3’3’5