植保生物技术实验安排

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1、分组：第一组：植保1班（2号李丁-29号蓟晓玲）第二组：植保1班（31号尹晓娟-56号郭嗣瑞）第三组：植保2班（1号刘小慧-25号谢佼昕）第四组：植保2班（26号吉夏洁-57号杨鹏飞）每组一整天（上午8点，下午2点半）共15个学时，所开实验如下：实验一：生技实验室主要仪器介绍及注意事项实验二：质粒DNA的制备实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验四：运用多聚酶链式反应技术进行基因扩增实验五：琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果实验一：生技实验室主要仪器介绍及注意事项主要介绍进入实验室注意事项；主要仪器设备的用法

2、及注意事项；有毒试剂的用法及注意事项等。实验二：细菌基因组DNA的制备　　一、实验目的通过本实验掌握细菌基因组DNA。二、实验原理首先破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可经通过过的RNaseA除去。三、仪器和试剂（一）材料细菌培养物。（二）设备　　移液管,高速冷冻离心机,台式离心机，水浴锅。（三）试剂　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶

3、解于80mlH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml。　　2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%乙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/LNaCl。四、操作步骤：　　1.100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。　　2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。　　3.加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。

4、　　4.加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。　　5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。　　6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。　　7.加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。　　8.离心DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1ml用RNA酶A水（10μg/ml）中室温放置一段时间,-20℃保存。实验三：琼脂糖凝胶电泳检测细菌基因组DNA一、实验目的通过本实验学

5、习琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA的方法和技术二、实验原理电泳是用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。当装备一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿起双螺旋骨架两侧带有负电和的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动里和来自你叫的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。因此就可以依据DNA分子的大小来使其分离。该过程可以通过把示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一

6、个用于确定DNA大小的标准。DNA在电泳过程中，与琼脂糖中的溴化乙锭嵌合，在透射紫外仪下呈橘红色。三、仪器和试剂（一）仪器1．电泳槽和电泳仪2．凝胶成像系统3．电子天平4．移液枪（二）试剂1．琼脂糖2．溴化乙锭3．LoadingBuffer4．DNA分子量标准参照物（DNAmarker）5．植物基因组DNA6.上样缓冲液（TBE）四、实验步骤（一）制备琼脂糖凝胶1．取0.16g琼脂糖置入装有20ml0.5XTBE的三角瓶中，微波炉加热沸腾使其溶于0.5XTBE中。加0.5µl溴化乙锭贮存液，混匀。2．

7、液温度降至65度左右，缓缓将其注入一个带有梳子的制胶床，避免有气泡产生。让胶在室温中冷却至凝固。在次期间：1）准备DNA样品2）胶凝固后，将胶床置于有0.5XTBE电极缓冲液的电泳槽中。通常，缓冲液高于胶面0.5cm。轻轻移去梳子，小心，不要使胶孔破裂。（二）上样及电泳1．吸取约含10ul的植物基因组DNA溶液，加2µl10XLoadingBuffer，用移液器吸取，缓缓注入凝胶上的加样孔。2．加样毕，用电源线连接电泳槽和电泳仪（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动），打开电源，设定电压或电流，开始

8、电泳。（三）染色及观察当指示剂迁移至凝胶约1-2cm处时，关闭电源取出凝胶，染色、脱色后在紫外灯上观察并拍照。实验四：运用多聚酶链式反应技术进行基因扩增一、实验目的通过本实验学习PCR反应基本原理和实验技术二、实验原理PCR（polymerasechainreaction,PCR）技术快速敏感、简便易行，其原理与细胞体内发生的DNA复制过程十分相似。首先是双链DNA在临近沸点的温度下变性分离成两条DNA分子单链，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，以反应