《基因工程的定义》word版

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1、1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2.碱抽提法提取质粒DNA原理和步骤3、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：3.DNA的凝胶电泳的原理相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。4.限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链

2、的核酸内切酶。功能即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：5’端凸出（如EcoRI切点）；’端凸出（如PstI切点）限制性内切酶识别的序列1.长度：一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。•4个碱基:sau3AⅠ•

3、5个碱基:EcoRⅡ•6个碱基:EcoRⅠ•7个碱基:BbvCⅠ•8个碱基:NotⅠ限制酶识别序列的结构大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。有些识别非对称序列，有些可以识别多种序列，ACCⅠ识别序列是GTÜMKAC,可以识别4中序列；有些识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基位点偏爱(sitepreferences)某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。酶切反应条件缓冲液，反应温度，反应时间，反应中止星星活

4、性(staractivity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的因素①高浓度甘油（>5%）②酶过量（>100U/mg）③低离子强度（<25mM）④高pH(>pH8.0)⑤有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane⑥用其它二价阳离子代替Mg++Mn++，Cu++，Co++,Zn++不同的酶对上述条件的敏感性不一样Ps

5、tI比EcoRI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感同裂酶（Isoschizomers)识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项1.DNA的纯度DNA聚合酶3’®5’外切酶活性5’®3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰

6、T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高2.DNA的甲基化程度3.温度4.缓冲液(Buffer)T4DNA连接酶的功能主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。大肠杆菌DNA聚合酶I①一条单链多肽。②5’®3’外切酶活性位于N端。5’®3’DNA聚合酶活性3’®5’外切酶活性在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活

7、性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得dsDNA成为平末端。Klenowfragment具有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性。（失去了5’®3’外切酶活性）。在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。来源RNA肿瘤病毒。AMV的性质二链多肽(62kDa/94kDa)具5’→3’DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)碱性磷酸酶该酶可从DNA分

8、子的5’端去除磷酸基碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5’磷酸，以防止自身连接。核酸分子杂交定义用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature,Tm)，此时50