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1、免疫分析法1,熟悉免疫分析法的基础知识,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述基本原理基本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,基本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反应
2、Ag*:标记抗原Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物,Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反应须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所加入Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;
3、F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag](三)抗原一抗体反应的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragmentofantigenbinding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.交叉反应(crossreaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电
4、力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.以沉淀免疫反应为例二,基本条件三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(AntigenicSpecifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.
5、1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原)本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1)载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA),兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白
6、(HSA)(2)半抗原的选择药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酐法③戊二醛法④琥珀酸酐法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比.(2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度
7、,可求出结合物中药物的含量.(3)放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.4.标准抗原(Standardantigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴
