GB-T18936-2003 高致病性禽流感诊断技术

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1、ICS11.220B41中华人民共和国国家标准GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza2003一01一10发布2003一05一01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/T18936-2003目9舀高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza，简称HPAI)是由正猫病毒科流感病毒属中的A型流感病毒引起的，被世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeInter-nati

2、onaldesEpizooties(法),OIE〕列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。本标准是参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(200。年版)，并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准的附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准起草人:唐秀英、李海燕、田国斌。GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术范围本标准规定了高致病性禽流感(HPAD病毒分离与鉴定技术、血凝(HA)和血梁抑

3、制(HI)试验、琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验、酶联免疫吸附试验(间接ELISA)的技术要求。本标准所规定的高致病性禽流感病毒分离与鉴定技术适用于各种禽类高致病性禽流感的病原分离和鉴定;AGID和间接ELISA适用于A型禽流感病毒的型特异性检验:HA-HI试验适用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定。2病毒分离和鉴定技术2.1材料准备2.1.1病料的采集:死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理;活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是以采集气管拭子更好;小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。2.1.2病料的保存:病料应放在含有抗菌素的pH值7.0-7.4的

4、等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内(无PBS可用25%^50%的甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL),链霉素(2mg/ml-)、庆大霉素(50pg/ml-)和制霉菌素(1000IU/ml)，但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加人抗生素后pH值应调至7.0-7.4。在室温放置1h---2h后样品应尽快处理，没有条件的可在4'C存放几天，也可于低温条件下保存(-70`C贮存最好)。2.1.3病料的处理:将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子;粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.0-7.4的等渗PBS溶液配成10写^-20%(g/

5、mL)的悬液。样品液经1000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。22病毒分离2.2.1样品接种:取处理好的样品，以0.2ml丫胚的量经尿囊腔途径接种9日龄-11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，于350C--370C孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。2.2.2病毒收获:无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应说明可能有正薪病毒科的流感病毒;若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性2.3病毒鉴定2-3.1A型流感病毒的型特异性鉴定:样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活

6、性鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)制成抗原，与A型禽流感病毒标准阳性血清进行AGID试验，检测样品中是否含有A型流感病毒。2,3.1.1抗原制备:从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2的PBS冲洗后，将CAM用研磨器磨碎磨碎的抗原反复冻融3次~4次，以1000r/min离心10min后取上清，按终浓度为0.1%的量加人甲醛溶液。置37'C温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中含有A型禽流感病毒。2.3.1.2AGID试验方法:按本标准第4章中的方法进行。2.3.2血凝

7、素亚型鉴定:当鸡胚尿囊液具有血凝活性时，首先应排除血凝活性是否由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。鸡胚尿囊液具有血凝活性或证明GB/T18936-2003含有A型流感病毒存在后，采用HA-Hl试验方法(按本标第3章中的方法进行)，用禽流感病毒15种血凝素(H1-H15)亚型分型血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。2.4致病性测定禽流感病毒致病性