2018中国的结直肠癌共识

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1、实用标准文案指南共识结直肠癌KRAS基因突变检测专家共识2013-02-2808:40来源：中华病理学杂志作者：卫生部病理质控与评价中心等全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年病死人数超过60万，发病率居第3位，病死率居第4位。近些年，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。因此，结直肠癌的治疗一直是国内外学者研究的热点。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂西妥昔单抗（Cetuximab）和帕尼单抗（Panitumumab）的问世，结直肠癌的治疗进入了靶向治疗时代。多个大样本、多中心Ⅲ期临床研究结果提示，KRAS基因第2号外显子第12、13位密码子的突变状态与阻断EGFR的单克隆抗

2、体——西妥昔单抗、帕尼单抗的疗效明确相关，KRAS野生型的患者可以从西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗中获得最大化的生存效益，从此结直肠癌的治疗揭开了个体化治疗的新篇章。早在2009年，美国临床肿瘤学会（ASCO）即建议对于转移性结直肠癌患者，在选择抗EGFR的单抗药物（西妥昔单抗或帕尼单抗）治疗前应检测KRAS基因状态。美国《国家综合癌症网络（NCCN）结直肠癌临床实践指南》（2011年）也指出，使用西妥昔单抗或帕尼单抗的患者应检测肿瘤KRAS基因突变状态。中国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范（2010年版）》中推荐西妥昔单抗用于治疗KRAS基因状态野生型患者。同前有关KRAS基因突变的检测方法很

3、多，参与检测的机构众多，缺乏统一的标准，本文旨在就现有的KRAS的检测流程以及常用检测方法给予简要介绍和评价，为临床病理工作提供指导。一、检测标本1.标本类型：（1）手术切除的标本：新鲜组织和（或）石蜡包埋组织；（2）肠镜等活检标本；手术切除标本及活检标本均且有的病例，建议用手术切除标本进行检测；（3）血液：应用血液标本进行检测目前尚处于研究阶段，不推荐应用。2.标本处理：（1）新鲜组织直接提取DNA。（2）石蜡包埋组织的标本处理：所有标本离体后及时进行标记、切开、固定等处理。应用新鲜配制的4%中性甲醛缓冲液固定标本，避免使用Bouin液等含重金属离子的固定液。固定液的量应至少为组织体积的

4、10倍。活检标本固定6-12h，手术标本固定6～48h。固定温度以正常室温为宜。蜡块保存温度在32℃以下。二、检测方法1.组织获取：所有标本进行基因突变检测前均先行常规病理检查和诊断（HE染色），必须经有经验的病理医师确定健康肿瘤细胞的百分比（肿瘤细胞/精彩文档实用标准文案整张切片所有细胞，估算），必要时应采取富集肿瘤细胞的方法，如手工刮取（macrodissection）或显微切割法（microdissection）。选取以肿瘤细胞为主的、没有明显的坏死、黏液和炎性改变的组织进行检测。肿瘤细胞数量要求尚无统一标准，至少应有100个肿瘤细胞，具体视所用DNA提取方法和突变检测方法的敏感度等

5、而定。2.DNA提取：DNA的质量很重要，一定要按标准的操作程序提取DNA，并进行严格的质控。目前没有统一的标准方法，对于手术标本，可采用常规的商品化DNA提取试剂盒。对于活检标本，推荐使用能提取石蜡包埋组织微量DNA的试剂盒。提取的DNA建议先测定浓度，并进行质量评估后再用于基网突变检测。3.突变检测方法：方法很多，目前没有统一标准，各实验室可以根据实际情况选择应用，同时应充分了解所用检测方法的优缺点及局限性。所有方法建立前应进行有效性验证。表1中列出了KRAS基因常见的突变类型。表1KRAS基因常见突变类型（1）直接测序（directsequencing）法：是目前应用最多的一种检测方

6、法，主曼是Sanger测序法。其基本原理是进行DNA合成反应时，正常掺入dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）会使DNA链延伸，如果掺入dideoxyNTP（ddNTP），则会使DNA链延伸终止。DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号可被检测系统检测。突变基因需要超过20%才能检测到突变信号。优点是能检测到已知突变和未知突变位点。但操作步骤多，检测周期较长。（2）荧光即时定量PCR法（real-timePCR）：通过检测荧光，实时监测PCR反应进行的过程。基于real-timePCR的方法较多，下面就两种常见的技术

7、方法做简要介绍。①ARMS（amplificationrefractorymutationsystem）法：该方法是利用与荧光探针相连的特定引物（蝎形或环形）进行的即时定量PCR。通过将与探针部的突变部位结合的邻近碱基（第2个碱基）与错配的碱基替换，并与阻断延伸反应的“ARMS”技术结合，提高特异性，从而可以进行高灵敏度测定。灵敏度1%左右，只能检测已知突变位点。②Taqman探针法：在real-timePCR反应中加入